АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Определение активности фактора 3 тромбоцитов (пластиночного фактора 3, ПФ-3) и его доступности

Принцип: За основу метода взято одно из отличий яда гюрзы и тканевого тромбопластина: в яде нет фосфолипидных аналогов ПФ-3. Поэтому лебетоксовый тест изменяется при дефиците тромбоцитов и недостаточном высвобождении из них ПФ - 3. Для исключения дефицита плазменных факторов, влияющих на этот тест, предварительно исследуют лебетокс-кефалиновое время.Если оно нормальное, то изменение базисного лебетоксового теста обусловлено дефицитом ПФ-3. После подсчета содержания тромбоцитов определяют активность ПФ-3 в исследуемой плазме до и после агрегации тромбоцитов, стимулированной АДФ, по лебетоксовому времени плазмы со стандартизированным количеством тромбоцитов в присутствии каолина.

Зависимость лебетоксового времени от количества тромбоцитов в плазме круто изменяется, когда тромбоцитов от 0 до 70 109/л, и слабо - при более высоком их содержании в плазме. Поэтому активность ПФ-3 исследуется после искусственного снижения содержания тромбоцитов в плазме до 70 109/л. Для этого богатые тромбоцитами плазмы исследуемого и здорового человека (контроль) разводятся их же бедными тромбоцитами плазмами для доведения в исследуемом образце количества тромбоцитов до необходимого уровня.

Реактивы: 1. 3,8% раствор цитрата натрия; 2. 0,277% раствор хлорида кальция; 3. Рабочий раствор яда гюрзы активностью 25 + 2 с; 4. Раствор АДФ в буфере Михаэлиса (рН 7,3) в концентрации 1 мг/10 мл. 5. Взвесь каолина в буфере Михаэлиса 5 мг/мл.

Ход определения: Богатую тромбоцитами плазму делят на две части по 1 мл. Одну из них центрифугируют 20 минут при 4000 об/мин для получения бедной тромбоцитами плазмы. В оставшейся части подсчитывают число тромбоцитов (в камере Горяева при фазовом контрасте). Затем разводят эту плазму собственной бедной тромбоцитами плазмой для получения образца плазмы, в котором будет около 70 109/мл тромбоцитов (по расчету).

Определение условной нулевой точки отсчета (опыт 1). К 0,1 мл бедной тромбоцитами исследуемой плазмы при 37^оС добавляют 0,1 мл взвеси каолина в буфере Михаэлиса. Смесь 2 мин инкубируют, затем к ней добавляют 0,1 мл рабочего раствора яда гюрзы и 0,1 мл 0,277% раствора хлорида кальция. Включают секундомер и регистрируют время свертывания. Время свертывания бедной тромбоцитами плазмы здорового человека обычно в пределах 37,3 + 0,6 с.

Определение по этой же методике лебетокс-каолинового времени в плазме со стандартном снижением содержания тромбоцитов до 70 109 л (опыт II). Проба с ядом гюрзы, как правило, продолжается 26,8+ 0,7 с. В образце плазмы со стандартизированно сниженным содержанием тромбоцитов 10 мин проводят агрегацию, используя в качестве агрегирующего агента АДФ (опыт III). Для этого к 2 мл исследуемой плазмы, в которой мало тромбоцитов, добавляют 0,2 мл раствора АДФ и, помешивая, осуществляют агрегацию. Затем плазму центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин для осаждения агрегатов. В надосадочной жидкости определяют лебетокс-каолиновое время свертывания, которое обычно равно 19,9 + 0,6 с.

Расчет активности ПФ-3 по формуле: (время свертывания в опыте II в контроле / время свертывания в опыте III в исследуемой плазме) х 100.

Нормальные величины: 100%.

Доступность (освобождение) ПФ -3 в процессе АДФ -агрегации тромбоцитов определяют по формуле:

(время свертывания в опыте III в контроле / время свертывания в опыте III в исследуемой плазме) х 100.

Нормальные величины: 100%.

Оценка результатов: Снижение ПФ-3 (удлинение времени свертывания в опыте 2) отмечается у страдающих некоторыми тромбоцитопатиями и тромбоцитопениями. Нарушение доступности (освобождения) ПФ-3 в процессе агрегации тромбоцитов определяется по отсутствию или замедленному ускорению времени свертывания в опыте III (после добавления АДФ) по сравнению с опытом II. Укорочение времени свертывания в опыте I свидетельствует о внутрисосудистой активации тромбоцитов с освобождением фосфолипидных активаторов свертывания.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 901 | Нарушение авторских прав