 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).Метод непрямой иммунофлуоресценции, принцип которого заключается в том, что специфические трепонемные антитела исследуемой сыворотки больного после реакции с трепонемным антигеном (взвесь бледных трепонем, штамм Nichols) визуализируются при люминисцентной микроскопии препарата с помощью сыворотки против иммуноглобулинов человека, меченой флюорохромом (флюоресцеин изотиоцианат), певоначально был предложен в работе Deacon с соавт. (1957). Для снижения значительного количества наблюдаемых ложноположительных реакций в дальнейшем были разработаны несколько модификаций реакции иммунофлюоресценции (РИФ): - РИФ-200 - с предварительным разведением исследуемой сыворотки 1:200, что снижает количество ложно-положительных реакций (Deacon с соавт., 1960); - РИФ-ц - модификация реакции иммунофлюоресценции для диагностики сифилитических поражений центральной нервной системы с использованием цельной спинномозговой жидкости (Harris с соавт., 1960); - РИФ-абс - реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией, когда групповые антитела удаляются из исследуемой сыворотки с помощью абсорбции разрушенными ультразвуком культуральными непатогенными трепонемами, что повышает специфичность реакции (Hunter с соавт., 1964);
- модификация РИФ-абс с двойной окраской использует антитела против IgG человека, меченые тетраметилродамином-изотиоцианатом идополнительную окраску препарата ФИТЦ-меченым конюгатом антител против T.pallidum, что позволяет избежать использования микроскопии в темном поле при отсутствии антител к бледной трепонеме в исследуемой сыворотке; двойная окраска позволяет различать нереактивные результаты, связанные с отсутствием антител от результатов, связанных с отсутствием трепонем на стекле (Hunter с соавт., 1979); - модификация IgM-РИФ-абс основана на выявлении ранних противотрепонемных антител класса IgM в реакции иммунофлюоресценции с помощью ФИТЦ-меченого конъюгата анти-IgM человека; - модификация (19S 1|^М)-РИФ-абс ставится, как и IgM-РИФ-абс, но не с Из всех модификаций реакции непрямой иммунофлюоресценции (РИФ) в регламентирующий приказ Минздрава СССР №1161 от 02.09.1985 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» вошли следующие: РИФ-абс, РИФ-200 и РИФ-ц. В приложении к приказу даны подробные методики их постановки. В РИФ можно также определять титр антител по наибольшему разведению сыворотки крови (используется фосфатный буфер), дающему положительный результат. Результаты реакции иммунофлюоресценции оценивают следующим образом: положительными считают сыворотки крови, которые дают свечение на 4+, 3+ и 2+: блестящее зелено-желтое свечение оценивается на 4+; яркое - на 3+; слабое свечение - на 2+. Отрицательными считают сыворотки, которые дают свечение на 1 + (трепонемы в препарате окрашены немного интенсивнее фона) или не окрашены. В зарубежной практике результаты РИФ оцениваются по шкале с меньшей градацией, а именно как «реактивные», «слабо реактивные» и «нереактивные» или «с наблюдаемым атипичным свечением». Рекомендуется повторное тестирование «слабо реактивных» проб сывороток с 1-2 недельным интервалом. По данным, приведенным в обзоре Г.А.Дмитриева (1999), чувствительность РИФ-абс и РИФ-200 оценивается 84-99%, а специфичность - 97-99%; для (19S IgM)-PИФ-aбc автор приводит более низкие значения чувствительности 50-73% и специфичности - 97%. По данным, приведенным в обзоре Larsen (1995) чувствительность и специфичность различных модификаций РИФ составляет:
РИФ, как и РИТ, согласно приказу Минздрава СССР №1161, рекомендуются для диагностики скрытых и поздних форм сифилиса, распознавания ложно-положительных результатов КСР и MP, особенно у беременных и соматических больных при клиническом, эпидемиологическом и анамнестическом подозрении на сифилис, для установления ретроспективного диагноза заболевания. РИФ-ц используется согласно регламентирующему приказу для ранней диагностики поражений нервной системы при сифилисе. РИФ не пригоден для оценки результатов лечения: у 85% пролеченных положительные результаты РИФ сохраняются годами. IgM-РИФ-абс и (19S IgM)-PИФ-aбc разрабатывались для целей серодиагностики врожденного сифилиса, как реакции, позволяющие исключить анти-трепонемные IgG материнского происхождения; для дифференцировки реинфекции от рецидива сифилиса, при котором РИФ-абс будет реактивной, а IgM-РИФ-абс -нереактивной, для оценки результатов лечения раннего сифилиса (по негативации результатов IgM-РИФ-абс). Но специфичность вышеназванных тестов для диагностики врожденного сифилиса была подвергнута сомнению рядом клинических наблюдений, согласно которым возможно получение ложно-положительных результатов при тестировании нормальных новорожденных. Поэтому эти тесты носят статус исследовательских. Как и все многокомпонентные реакции, РИФ сложна и трудоемка в постановке, стандартизация метода требует наличия хорошо оттитрованных конъюгатов, контролей с разной степенью реактивности, стекол с мазками, содержащими достаточное количество трепонем. Работа с люминисцентным микроскопом требует навыков высококвалифицированного персонала, производительность работы за микроскопом ограничена из-за утомляемости глаз. Готовые реагенты для РИФ дорогостоящи (например, SYPHILAM производства Sanofi Diagnostics Pasteur). Лабораторное же приготовление взвеси патогенных трепонем штамма Nichols из 7-суточного орхита кроликов, требует значительных затрат на содержание вивария. Поэтому, несмотря на высокую чувствительность и специфичность, РИФ в основном используется в качестве референс-метода в отдельных базовых серологических лабораториях. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) для выявления антител к антигенам T.pallidum. Реакция пассивной гемагглютинации для серодиагностики сифилиса была разработана в работах Rathlev (1965, 1967). Позже в работе Сох с соавт. (1969) была предложена микромодификация РПГА. Принцип реакции состоит в агглютинации эритроцитов, сенсибилизированных трепонемным антигеном в присутствиии специфических противотрепонемных антител в исследуемой сыворотке. Формалинизированные эритроциты барана или птиц, обработанные таннином сенсибилизируются ультраозвученным антигеном Treponema pallidum (штамм Nichols). В качестве отрицательного контроля используются несенсибилизированные эритроциты, чтобы исключить наличие антиэритроцитарных антител, которые могут приводить к ложно-положительным результатам. В каждой серии постановок обязательно используются положительный и отрицательный контрольные образцы. Метод оказался исключительно простым, дешевым и чувствительным. Постановка РПГА не требует специального оборудования, за исключением планшета для гемагглютинации. Результат реакции учитывается через 45-60-120 минут визуально. Диагностикумы с использованием более крупных (ядерных) эритроцитов птиц дают более четкую картинку агглютинации в более короткие сроки (45 минут). Постановка реакции максимально проста. На примере набора "Люис РПГА тест" в две лунки микропланшета вносится по 25 мкл исследуемой сыворотки, разведенной 1:20 прилагаемым в набор буфером, затем добавляется по 1 капле (75 мкл) из фиксированной капельницы на флаконе тест-эритроцитов, сенсибилизированных трепонемным антигеном в первую лунку, и контрольных несенсибилизированных эритроцитов в другую лунку. Планшет слегка покачивается и оставляется при комнатной температуре на 45 минут. При положительном результате эритроциты равномерно выстилают всю поверхность лунки в виде зонтика; при меньшей концентрации антител часть эритроцитов соскальзывает к центру лунки; слабоположительная реакция характеризуется образованием пленки эритроцитов на части поверхности лунки и скоплением значительного количества эритроцитов в центре на дне лунки (часто в форме кольца или «пуговки» с центральным просветом); при отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок («пуговку») на дне лунки. Количественный метод постановки РПГА с помощью двукратных разведений исследуемой сыворотки позволяет оценить концентрацию специфических трепонемных антител в крови. РПГА обычно становится положительной спустя 3 недели после появления твердого шанкра. Это несколько позже по сравнению с РИФ-абс при первичном сифилисе. По данным Беспаловой Г.И. с соавт. (1999) сравнительное исследование 300 сывороток от больных различными формами сифилиса в РИТ, РСК, РИФ, РПГА (Люис РПГА тест) выявило большую чувствительность РПГА по сравнению с РИТ (13% в пользу РПГА) и РСК(24% в пользу РПГА). Положительной РПГА остается у пациентов, перенесших сифилис, в течение многих лет. Сравнение двух стандартных трепонемных тестов РИФ-абс и РПГА, приведенное в обзоре Larsen (1995), говорит о том, что РПГА дает меньшее количество ложно-положительных результатов среди здорового населения (менее 1%). Ложно-положительные результаты могут наблюдаться у больных с инфекционным мононуклеозом, у наркоманов, при коллагенозах, лепре и др. заболеваниях, что необходимо учитывать при дифференциальной диагностике. В зависимости от стадии сифилиса чувствительность РПГА составляет: 76% при первичном сифилисе; 100% при вторичном сифилисе; 97% при скрытом сифилисе; 94% при позднем сифилисе. Специфичность РПГА оценивается выше чем специфичность РИФ-абс и составляет 99%. По соотношению специфичности, чувствительности, простоты постановки, стандартизации реагентов и стоимости среди трепонемных тестов для серодиагностики сифилиса реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) стабильно заняла лидирующее место в клинической практике в мире. В России применение РПГА регламентировано приказом Минздрава РФ №2S6 от 07.12.1993 г. «Осовершенствовании контроля за заболеваниями, передаваемыми половым путем» (п. 1.11.), а также Информационным письмом Минздравмедпрома РФ от 01.12.1995 г. В методическом плане применение РПГА разъяснено в методическом пособии проф. Дмитриева Г. А.с соавт. «Реакция пассивной гемагглютинации для серодиагностики сифилиса», утвержденном Ученым Советом ЦНИИКВИ, протокол №7 от 24.06.1998 г. В пособии приведен перечень диагностических наборов на основе РПГА, зарегистрированных в России, среди них наборы зарубежных фирм; Human (Германия), Sanofi Diagnostics Pasteur (Франция), Or-ganon Teknika (Бельгия), Randox {Великобритания) и отечественных производителей ТПР-ЦКВИ-диагностика (ЦНИИКВИ, Москва) и Люис РПГА тест (ЗАО «Ниармедик Плюс» при НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва). Среди отечественных производителей сертифицировано производство диагностических наборов только в компании «Ниармедик Плюс». Качество тест-системы «Люис РПГА тест» подтверждено в независимых испытаниях, проведенных в Отделе лабораторных исследований на СПИД, заболевания, передаваемые половым путем и туберкулез Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), Атланта, США в августе 1998 г. Согласно полученному заключению «Люис РПГА тест» сопоставим с аналогичным подтверждающим тестом фирмы Fujirebio, наиболее широко используемым в Соединенных Штатах. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) на антитела против антигенов T.pallidum. Иммуноферментный метод диагностики (ИФА) для выявления антител класса IgG к антигенам T.pallidum был разработан в 1985 г. Farshy, Hunter с соавт. Принцип метода заключается в выявлении сорбированного на твердой фазе (поверхность лунок пластикового планшета) специфического комплекса антиген-антитело антиглобулиновыми антителами, мечеными ферментом (пероксидазой), с помощью цветной реакции с субстратом, учитываемой количественно спектрофотометрически. Итак, на поверхности лунок полистиролового планшета сорбированы антигены T.pallidum. Антиегны, применяемые для сенсибилизации планшета могут быть: - лизатными - полученными в результате лизиса или разрушения ультразвуком T.pallidum; - рекомбинантными - полученными с помощью методов генной инженерии -белки, несущие антигенные детерминанты идентичные T.pallidum; - пептидными - полученными в результате химического синтеза фрагментов белков T.pallidum, имеющих антигенную реактивность, аналогичную исходным белкам возбудителя. В лунки сенсибилизированного антигенами планшета помещают исследуемые Качество иммуноферментных тест-систем зависит от многих факторов, но в первую очередь от качества использованного антигена, от того насколько используемый антиген иммуногенен, то есть от того насколько полно представлены в нем антигенные детерминанты, на которые организм больного вырабатывает значительное количество антител на разных стадиях болезни. Используемые в ИФА антигены не должны давать перекрестных реакций с групповыми антигенами спирохет, чтобы избежать ложно-положительных реакций, а также с антителами другой специфичности, не имеющими отношения к T.pallidum. Во многом качество ИФА-тест-систем зависит от качества отчистки антигена, особенно в случае использования рекомбинантных белков. Следующий фактор, определяющий качество ИФА-наборов - качество конъюгата -препарата антител к отдельным классам иммуноглобулинов человека, меченых ферментом. Использование для получения конъюгата моноклональных антител к иммуноглобулинам человека снижает уровень неспецифических реакций. Особый интерес и сложность в разработке представляют ИФА-тест-системы для выявления антител класса IgM к антигенам T.pallidum. Это связано с необходимостью ранней диагностики сифилиса (IgM появляются уже через 2 недели после заражения), диагностики врожденного сифилиса (наличие диагностических титров IgM к антигенам T.pallidum служит серологическим подтверждением врожденного сифилиса, в отличие от IgG, передающихся от матери ребенку). Обычные схемы ИФА-тест-систем для выявления антител класса IgM к антигенам T.pallidum, как описано выше, дают значительное количество ложно-положительных результатов.
По данным, приведенным в обзоре Г.А. Дмитриева (1999), чувствительность различных вариантов ИФА оценивается 98-100%, а специфичность - 96-100%. Основные преимущества ИФА заключаются: в высокой чувствительности и специфичности метода; автоматизации постановки реакции; высокой степени стандартизации, возможности исследования большого количества образцов сывороток; в количественном учете и объективной документации полученных результатов; возможности одновременного определения титра противотрепонемных антител различных классов (IgG и IgM) в одном образце; пригодности для ранней диагностики сифилиса и диагностики врожденного сифилиса; в удобстве применения для тестирования крови в службе переливания крови; применимости в качестве подтверждающего специфического трепонемного теста. К недостаткам ИФА можно отнести возможность получения неспецифических результатов при выявлении антитрепонемных антител класса IgM в случае использования обычных, а не ловушечных вариантов ИФА; ИФА не подходит для исследования единичных образцов; метод дорог, требует оснащения лаборатории специальным оборудованием; получение результата в ИФА более длительное, например по сравнению с РПГА; ИФА-неборы имеют меньший срок годности, например по сравнению с РПГА. В России есть ряд отечествественных производителей ИФА-наборов для диагностики сифилиса, среди которых ГП «Аллерген», Ставрополь; АОЗТ «Диаклон», Москва; ЗАО «Вектор-Бест», Кольцово Новосибирской обл.; ЗАО «Вектор-Майстар», Кольцово Новосибирской обл., НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород; ЗАО «Ниармедик Плюс» при НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва; ТОО «ЭКОЛаб», Электрогорск Московской обл., а также целый ряд зарубежных фирм, имеющих регстрацию ИФА тест-систем на сифилис в РФ. В настоящее время зарегистрированы и разрешены к применению две отечественные тест-системы для выявления антитрепонемных IgM - "ЛюисСтрип М» производства ЗАО «Ниармедик Плюс» и «РекомбиБест антипаллидум IgM» производства «Вектор-Бест». На российском рынке пока отсутствуют отечественные ловушечные ИФА-наборы для выявления антитрепонемных IgM, также как и зарегистрированные зарубежные наборы. В России применение ИФА регламентировано приказом Минздрава РФ №286 от 07.12.1993 г. «О совершенствовании контроля за заболеваниями, передаваемыми половым путем», а также Информационным письмом Минздравмедпрома РФ от 01.12.1995 г., а также отдельными приказами по службе крови. Дата добавления: 2015-11-26 | Просмотры: 1302 | Нарушение авторских прав |
В 1989 г. в работе Ijsselmudien с соавт. был предложен метод ловушечного ИФА для выявления антител класса IgM к антигенам T.pallidum, обладающий высокой специфичностью и чувствительностью.В ловушечном ИФА на поверхности лунок планшета сорбированы очищенные антитела к иммуноглабулинам человека класса IgM. В результате инкубации исследуемой сыворотки все IgM связываются с носителем. Наличие среди связанных IgM специфичных для антигенов T.pallidum выявляется с помощью антигенов T.pallidum, конъюгированных с ферментом.