АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была открыта в 1983 г. Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарной построение двойной цепи ДНК. Репликация ДНК начинается не в произвольных точках, а в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. Суть метода заключается в том, что маркировав такими блоками специфический только для данного микроорганизма участок ДНК (консервативный фрагмент), можно неоднократно воспроизвести (амплифицировать) этот участок. Для осуществления процесса в лабораторных условиях используют специфические олигонуклеотидные последовательности, называемые праймерами, служащие в качестве затравки синтеза специфического фрагмента. При внесении в исследуемую пробу выделенной ДНК праймеры присоединяются только к комплементарным участкам (отжиг), после чего начинается репликация ДНК с помощью термостабильного фермента - Taq-ДНК-полимеразы. Синтезированные нити ДНК служат в качестве матрицы для синтеза в новом цикле. Это и есть полимеразная цепная реакцияю Количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогресии. Через 25 циклов амплификации синтезируется 10⁶ копий специфического выбранного фрагмента. 30-40 циклов амплификации обычно достаточно для получения такого количества специфических фрагментов ДНК, чтобы выявить их в виде отдельной полосы после электрофореза в агарозном геле. Теоретически можно выявить одну копию генома в образце.

ПЦР-тесты для выявления ДНК Treponema pallidum были разработаны в 1991 г. одновременно в нескольких лабораториях (см. Burstain с соавт., 1991). Для ПЦР-анализа использованы наиболее консервативные области генома Treponema pallidum:

- сегмент 658 н.п. гена поверхностного антигена 47 кД (липопротеин,

антигенная детерминанта которого, доминирует в имунном ответе человека

на сифилитическую инфекцию);

- сегмент гена основного мембранного белка 39 кД;

- генная последовательность ТтрА мембранного белка 45 кД и 4D антигена

(олигомерный белок).

ПЦР-тесты для детекции Treponema pallidum позволяют выявить исследуемых образцах эквивалент, равный 65 микроорганизмам.

Образцы для исследования в ПЦР-тестах: материал с поверхности эрозивных или язвенных элементов, амниотическая жидкость, неонатальная сыворотка, ликвор и др.

Применение ПЦР-диагностики сифилиса. не регламентировано органами здравоохранения. Метод имеет пока исследовательский статус Применение вПЦР праймеров для амплификации сегмента 658 н.п. гена поверхностного антигена 47кД Trepo­nema pallidum позволило получить общую чувствительность по сравнению с РИТ 78% для околоплодных вод и 60-67% для сыворотки и ликвора из-за наличия неспецифических ингибиторов ПЦР. ПЦР-диагностика неприменима для контроля излеченности, поскольку ДНК погибших T.pallidum также может быть амплифицирована.

Разработаннная ЗАО «Ниармедик Плюс» при НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва тест-система «Сифило ампли-тест» использует для амплификации фрагмент гена мембранного антигена 47 кД T.pallidum; режим амплификации - отжиг - +58°С; синтез (амплификация) - +72°С; денатурация - +94°С. В некоторых регионах России, например в г. Новосибирске тест-система «Сифило ампли-тест» рекомендована Управлением здравоохранения и лекарственного обеспечения Мэрии для

дифференциальной диагностики серопозитивности при раннем скрытом сифилисе и биологических ложноположительных серологических реакциях в сложных случаях в качестве дополнительного к имеющимся в настоящее время методам обследования. Имеются также работы по использованию ПЦР тест-систем на сифилис для исследования минипулов крови и препаратов крови.

Тест-система «Сифило ампли-тест», разработаннная ЗАО «Ниармедик Плюс» при НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва в настоящее время находится в стадии государственной регистрации.

Общепринятые за рубежом схемы диагностики сифилиса.

Клинические проявления заболевания сифилисом и стадия болезни полностью определяют арсенал необходимых для диагностики лабораторных тестов лабораторных тестов, но рутинно обычно притменяется унифицированный стандартный подход к диагностике сифилиса. Рутинная схема диагностики сифилиса должна снизить затраты на лабораторную диагностику, позволить макимально быстро получить результаты предварительного и подтверждающего тестов, чтобы без промедления назначить специфическую антибиотикотерапию. В США, в частности применяется слледующая рутинная схема диагностики (см схему на стр. 29).

При наличии у пациента характерного поражения кожи и слизистых и анамнестическом подозрении на наличие контакта производится микроскопическое исследование в темном поле серозных выделений из места поражения, и при положительном результате незамедлительно назначается лечене.

При отсутствии характерных поражений кожи и слизистых и при отрицательном результате микроскопического исследования в темном поле применяется исследование плазмы или сыворотки крови пациента в нетрепонемном тесте, обычно это быстрый плазмареагиновый тест - RPR-тест, выполняемый за 8 минут на карточках. При положительном результате скринингового теста определяется титр реагиновых антител (с целью контроля эффективности терапии и серонегативации в процессе лечения) и ставится трепонемный тест (чаще всего - РПГА). Отрицательный результат свидетельствует о ложно-положительной реакции (следует дополнительно разобраться в клинических проявлениях), а положительный результат трепонемного теста позволяет поставить диагнос сифилиса и назначить специфическую антибиотикотерапию.

Эпидемиология. Пути передачи инфекции.

Половой.

Наиболее частый и типичный путь инфицирования. Для заражения здорового человека необходимо наличие наружных проявлений сифилиса на коже или слизистых оболочках источника инфекции в виде мацерированных, эрозивных или язвенных элементов. Наиболее заразны твёрдые шанкры, а также мацерированные и эрозивные папулы вторичного периода, особенно расположенные на гениталиях и слизистой рта. Отделяемое элементов содержит большое количество трепонем. Однако заражение может произойти и через неспецифические высыпания. Больные ранним сифилисом заразны, если имеют герпетические высыпания, или эрозивный баланопостит, или эрозию шейки матки, либо другие неспецифические проявления эрозивного или язвенного характера.

Считают, что для проникновения бледной трепонемы через кожу или слизистые оболочки необходимо повреждение их целостности, микротравма. Это легко происходит в условиях полового контакта.

Дата добавления: 2015-11-26 | Просмотры: 460 | Нарушение авторских прав