АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Визначення гепарин-кофакторної активності антитромбіну ІІІ (ПАТ) (за Р. Л. Бік та співавт.)

У присутності гепарину антитромбін ІІІ перетворюється з повільно діючого у швидкодіючий інгібітор тромбу. Швидкість інактивації тромбіну пропорційна активності антитромбіну ІІІ зразка. Зниження зсідаючої активності інгібітором приводить до збільшення часу зсідання фібриногену.

Реактиви. 1. 3,8% розчин цитрату натрію. 2. 0,05 М трис- НСІ буфер рН 7,4, що містить 0,15 М NaСІ (6,05 г трису та 8,77 г NаСІ на 1л дистильованої води). 3. Розчин гепарину (20 од/мл) у тім самім буфері. 4. Розчин тромбіну (10 NІН од/мл) у буфері (0,2 мл тромбіну повинні викликати зсідання 0,3% розчину фібриногену за 23 сек. при 37 град.). 5. 0,2 % розчин фібриногену у тім самім буфері (розчин фібриногену готується на коагулюючому білку). У разі використання бичачого фібриногену виробництва Каунаського підприємства бакпрепаратів слід брати навісок N 6 мг/мл.

Приготування дефібринованої плазми: кров, змішану з 3,8% цитратом натрію у співвідношенні кров/консервант 9:1, центрифугують при 4000 об./хв. на протязі 20 хвилин. Відсмоктують бідну на тром­боцити плазму крові і видаляють фібриноген прогріванням зразка на водяній бані при 56 град на протязі 5 хв. (контроль температури у плазмі строго по термометру!). Зразок ставлять у холодильник (-8, -12 град) на 10 хв., а далі центрифугують 10 хв. при 3000 об./хв. Для визначення використовують супернатант.

Хід дослідження. У пластикову або силіконіровану пробірку, поміщену у водяну баню (37 град), додають 0,075 мл розчину гепарину і 0,4 мл розчину тромбіну. Через 30 сек. інкубації відбирають 0,2 мл суміші і переносять у пробірку з розчином фібриногену, яку попередньо нагрівають на протязі 1 хв. при 37 град. Вмикають секундомір і реєструють час зсідання фібриногену. Активність антитромбіну ІІІ знаходять по каліброваній кривій, що показує залежність часу зсідання фібриногену від вмісту (активності) антитромбіну ІІІ. Побудова каліброваної кривої: плазму крові, стабілізовану цитратом натрію, здобуту від 10 донорів, дефібринують по описаній вище методиці та змішують у рівних обсягах у одній пробірці. Після дефібринування вносять у 5 пробірок: 0,025 (100%, І од.); 0,020 (80%, 0,8); 0,015 (60%, 0,6); 0,010 (40%, 0,4) та 0,005 (20%, 0,2) дефібринованоі плазми. Доводять обсяг проб, за виключенням першої, до 0,025 мл 0,05 М трис-НСІ буфером 7,4, що містить 0,15 М NаСІ. Визначають гепарин-кофакторну активність кожного з розведень (усі вимірювання повторюють тричі і при достатньому збігові беруть середнє арифметичне з них). Будують калібровану криву на пів- логарифмічному папері, де на осі абсцис із міліметровим масштабом відкладають активність антитромбіну ІІІ у % співвідношенні з використаними розведеннями, а по осі ординат з логарифмічним масштабом - десятковий логарифм часу зсідання у сtr. Результати виражають у %, або у од/мл, приймаючи активність антитромбіну ІІІ у 1 мл цитратної плазми крові, що дорівнює 100% або 1 од.

Читання результатів. Антитромбін ІІІ - основний інгібітор тромбіну та фактору Ха, на частину якого припадає близько 80% антитромбіновоі активності плазми крові. Гепарин, що взаємодіє з антитромбіном ІІІ значно збільшує швидкість інактивації інгібітором ферментів системи гемостазу, у зв'язку з чим антитромбін ІІІ володіє, так званою, гепарин-кофакторною активністю. Зниження рівня антитромбіну ІІІ супроводжується тромбоемболічними ускладненнями. Існують спадкові - генетично обумовлені, та набуті форми дефіциту інгібітору. Спадковий дефіцит антитромбіну ІІІ зустрічається у популяції з частотою 1:5000 і може бути викликаний як зниженням біосинтезу інгібітору, так і аномаліями його молекули. Набутий дефіцит ан­титромбіну ІІІ зумовлений: 1) споживанням на інактивацію ферментів зсідаючої системи при її активації (ДВЗ-синдром, великі хірургічні втручання, гемодіаліз та ін.); 2) порушенням біосинтезу інгібітору при гострих ушкодженнях печінки та цирозах; 3) втратою антитромбіну ІІІ з біологічними рідинами внаслідок підвищеної судинної проникливості (нефротичний синдром, гострі запальні захворювання кишок, плазмаферез та ін.). Зниження рівня антитромбіну ІІІ спостерігається при гепаринотерапіі, введені аспарагінази та естрогенів. При зниженні вмісту інгібітору до 60-70 % введення гепарину не дає клінічно значимого антикоагулянтного ефекту.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 607 | Нарушение авторских прав