АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Кількісне визначення факторів VIII та IX

Визначається каолін-кефаліновнй час розведеної бідної на тромбоцити плазми крові хворого і стандартної контрольної плазми, одержаної від групи здорових осіб. Зумовлене розведенням зниження концентрації усіх плазмових факторів зсідання, окрім досліджу­ваних, компенсується додаванням плазми крові хворого із явно відомим значним дефіцитом факторів УІІІ та 1Х. Як активатори використовуються кефалін або інші замісники фактору ІІІ тромбоцитів і каолін. Додавання кефаліну (еритрофосфатиду) виключає порушення зсідання тромбоцитарного генезу і робить метод чутливим до дефіциту плазмових факторів зсідання та до- лишку у плазмі антикоагулянтів. Каолін використовується для активації контактної фази зсідання. У результаті на показники тесту впливає лише дефіцит досліджуваного фактору. За допомогою стандартної кривої розведення визначають ступінь дефі­циту факторів УІІІ та IX.

Реактиви. 1. Субстратна дефіцитна плазма. Використовується: бідна на тромбоцити плазма крові хворих тяжки­ми формами гемофілії А та В із встановленим різко вираженим дефіцитом факторів VIII та IX (1 - 3 %), одержувана при центрифугуванні крові на протязі 15 хвилин при 2000 об. Як консервант використовують 3,8 - відсотковий розчин цитрату натрію (9:1). Для отримання великої кількості субстратної плазми до­цільно провести хворим тяжкою формою гемофілії А та В плазмаферез, який дозволяє одержати 250 мл плазми із 500 мл крові хворого.

2. Стандартна плазма. Контрольну бідну на тромбоцити плазму заготовляють так само, як і плазму крові досліджуваних хворих та субстратну плазму. Оскільки у здорових осіб вміст у крові факторів УІП та IX коливається у значних межах, доцільно використовувати пул донорської плазми, яка складається із рівних обсягів 10 - 20 зразків плазми крові здорових осіб. Зразки стандартної та субстратної плазми зберігаються не більше трьох годин при 4 град. або на протязі місяця при 20 град.

3. Суспензія каоліну (білої глини) в еритрафосфатиді. Використовується 0,1-відсотковий розчин еритрофосфатиду в ізотонічному розчині (0,85% ) хлориду натрію. Готується суспензія 0,025 г каоліну у 0,5 мл 0,1 % розчину еритрофосфатиду і обсяг доводиться до 5 мл ізотонічним розчином хлориду натрію. Одержану суспензію перемішують на протязі 10 хвилин на магнітній мішалці при кімнатній температурі.

4. Імідазольний буфер рН 7,4 готується із концентрату (5 мл концентрату + 95 мл дистильованої води).

5. Розчин хлориду кальцію 0,025 моль/л.

Хід дослідження. Всі зразки плазм зберігаються на льоду на протязі усього часу дослідження. Визначення проводить­ся у стандартних умовах рН (імідазольний буфер), контактної (каолін) та фосфоліпідної (кефалін або еритрофосфатид) активації процесу зсідання. У центрифужні пробірки, які встановлені на водяній бані (37 град.), послідовно вводять по 0,1 мл розведеної буфером цитратноі плазми хворого (1:10), субстратної плазми та суміш каоліну з еритрофосфатидом. Вміст пробірок ретельно перемішують та інкубують на водяній бані на протязі 3 хвилин. Потім вводять 0,1 мл розчину хлориду кальцію і визначають час зсідання.

Побудова калібровочної кривої.

Для побудови калібровочноі кривої використовують слідуючи розведення стандартної плазми:

Читання результатів. Час зсідання стандартної контрольної плазми, розведеної імідазольним буфером у співвідношенні 1:10, приймається за 100 %. На білогарифічному папері по осі ординат відкладають час зсідання у секун­дах, а по осі абсцис - рівень дефіцитного VІІІ або IX фактору у відсотках. Кут нахилу кривої залежить від якості субстратної плазми. Нормальне значення факторів УІІІ та IX становить 70 - 200 %. Метод використовується для діагностики дефіциту факторів УІІІ та IX, визначення тяжкості гемофілії та контролю за замісною терапією хворих трансфузіями плазми або концентратами відповідних фак­торів зсідання.

Для визначення факторів УІІІ і ІХ можуть використовуватись відповідні фірмені контрольні і субстратні плазми, а також набори реагентів для визначення АПТЧ фірм Технологія-Стандарт і Ренам (Росія).

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 659 | Нарушение авторских прав