АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК)

Прочитайте:
  1. A) ответная реакция организма, возникающая под воздействием повреждающих факторов
  2. A) снижением бактерицидного действия соляной кислоты
  3. Acida (Кислоты)
  4. IV. Реакция эндокринной системы на гипогликемию
  5. IX. Вальпроевая кислота
  6. L Гипераминоацидурия - свидетельство нарушения реабсорбции аминокислот.
  7. А) никотиновая кислота
  8. А. Кожные пробы при аллергических реакциях немедленного типа
  9. АДСОРБЦИЯ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ НА ПОВЕРХНОСТИ АКТИВИРОВАННОГО УГЛЯ
  10. АЗОТНАЯ КИСЛОТА

Эта реакция была предложена К.Мюллисом в 1983 г, получившим за свое открытие Нобелевскую премию (1993).Это открытие стало настоящим прорывом в молекулярной биологии и медицине. Следует отметить, что способ получения и свойства главного компонента реакции - фермента термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерии Thermus aquaticus был опубликован А. Калединым с соавторами в 1980 г.

Полимеразная цепная реакция, также как и молекулярная гибридизация, основана на способности ДНК к денатурации и ренатурации и на комплементарное™ цепей ДНК. Новым важным принципом реакции является использование термо стабильной ДНК-пол им еразы, при участии которой происходит амплификация - умножение определяемых генов (вирусных, бактериальных) или их фрагментов с определенной нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительной количестве и может быть легко выявлен и идентифицирован. Именно на амплификации генов или их фрагментов основана "сверхчувствительность" этой реакции.

В реакции участвуют следующие ингредиенты: - определяемая ДНК вирусов или других инфекционных агентов в испытуемом биологическим материале, который предварительно концентрируется;

- праймеры 2-х типов (олигонуклеотиды) - короткие
цепочки ДНК с нуклеотидной последовательностью
комплементарной 3' концам каждой да двух цепей определяемой
ДНК. Праймеры получают из генов различных вирусов и бактерий,
их нуклеотидную последовательность определяют методом
секвенирования;

- свободные нуклеотиды (дезоксирибонукяеозидтрифосфаты
4-х типов с различными азотистыми основаниями) - необходимый
материал для осуществления амплификации;

-фермент термостабильная ДНК - полимераза -производит достройку комплементарных цепей ДНК из пула свободных нуклеотидов. Кроме термостабильной ДНК полимеразы выделяемой из Thermus aquaticus, этот фермент получают генно-инженерным методом.

Сущность ПЦР состоит в том, что определяемая ДНК, находящаяся в тестируемом биологическом материале, подвергается денатурации. Затем праймеры 2-х типов в условиях отжига присоединяются, вследствие их комплементарности, к 3' концам каждой из антипараллельных цепей, восстанавливая на этом участке двухспиральную структуру ДНК. Праймеры служат "затравками" для последующей достройки цепей ДНК, осуществляемой термостабильной ДНК-полимеразой, которая использует для этой цеди свободные нуклеотиды.

В результате одного цикла ПЦР количество молекул определяемой ДНК удваивается (из одной матрицы ДНК образуется две копии), то есть происходит амплификация ДНК, Обычно проводят 25 - 40 повторных циклов амплификации и в итоге за 2-3 часа получают миллионы копий специфического фрагмента ДНК вирусов, бактерий и др, (по формуле: 2П, где п равно количеству циклов),

Полимеразную цепную реакцию проводят в 0,5 - 1,5 мл микроцентрифужных пробирках в амллификаторах, которые автоматически регулируют смену температуры. Каждому из 3-х этапов цикла амплификации - денатурации ДНК, отжига и достройки - необходима инкубация образцов при различном температурном режиме (см. схему ПЦР, стр. 74).

1) Денатурация разъединение определяемой

двухспиральной ДНК на две изолированные цепи при нагревании до 90°- 95° С в течение 0,5 - 1,0 мин.

2) Отжиг восстановление двухцепочечной структуры
определяемой ДНК в области присоединения комплементарного
праймера - проводится при температуре 40-60 С 0,5 мин.

3) Удлинение (элонгация) - достройка каждой цепи
определяемой ДНК до исходного двухцепочечного состояния с
помощью термостабилыюй ДНК - полимеразы - проводится при
температуре 70°- 75° С в течение 2-5 мип.

Наличие ДНК после повторных циклов амплификации определяют с помощью электрофореза в полиакрил амид ном геле, авторадиографией (при участии в реакции свободных нуклеотидов, меченных изотопами) или другими методами. ПЦР высокоспецифичная реакция: если исследуемый образец не был комплементарен враймерам, то результат реакции отрицателен.

С помощью ПЦР возможно определение не только нуклеотидной последовательности ДНК, но также РНК и, следовательно, выявление РНК- вирусов (для этого в реакцию вводят обратную транскрштгазу).

Таким образом, ПЦР является высокочувствительным и специфичным молекулярно-генетическим методом исследования, позволяющем выявлять присутствие различных вирусов и многих других патогенных агентов. Метод особенно ценен для диагностики латентных вирусных инфекций и ВИЧ-инфекпии. ПЦР применяют также при диагностике холеры (обнаруживают ген, детерминирующий синтез энтеротоксина у холерного вибриона), бруцеллеза, легионеллеза, микобактериозов и других инфекций.

В последние годы ПЦР приобретает вес большее значение, как ценный экспресс-метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

 

 


Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 1453 | Нарушение авторских прав



1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 |



При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.004 сек.)