АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

МЕТОДЫ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ

Однослойные культуры клеток имеют первостепенное значение в диагностике большинства вирусных инфекций. С помощью клеточных культур удается обнаружить (индикация) и выделить вирус из исследуемого материала, поддерживать вирус в лабораторных условиях, и провести идентификацию вируса. Используя культуры клеток, выявляют противовирусные антитела в испытуемых сыворотках.

Для выделения и культивирования вирусов пригодны высоковосприимчивые (чувствительные) культуры клеток, в которых вирусы способны размножаться (репродуцироваться) в бесконечном ряде пассажей. Такими высокочувствительными культурами чаще всего являются культуры клеток человеческого

происхождения (первичные, перевиваемые, диплоидные), а также культуры клеток из почек обезьян. Нередко используют клеточные культуры, получаемые из тканей животных и птиц. В настоящее время подобраны высокочувствительные культуры клеток к подавляющему большинству известных вирусов. Определенные клеточные культуры обладают избирательной чувствительностью к тому или иному вирусу. Так, например, на почечных клетках обезьян хорошо размножаются полиовирусы, на перевиваемой культуре клеток HeLa - вирусы гриппа А и В, на первичной культуре фибробластов куриного эмбриона •• герпесвирусы и поксвирусы и т.п. Таким образом, чувствительность к вирусам определяется как свойствами клеток, так и природой вируса. Для успешной репродукции вирусов большое значение имеют состав питательной среды, в которой культивируются клетки, значение рН, присутствие сыворотки, температура инкубации, возраст, жизнеспособность и плотность клеточной популяции, множественность вирусной инфекции, синтез интерферона и др. факторы. Например, парагриппозные вирусы не репродуцируются в клеточной культуре, если в питательной среде присутствует сыворотка; риновирусы размножаются в культуре клеток при температуре 33°С, обязательно во вращающихся пробирках.

Учет всех этих данных может оказать определенную помощь в диагностике, позволяет проводить предварительную (ориентировочную) идентификацию выделяемого вируса.

Индикация, При заражении вирусами клеточных культур можно получать различные видимые проявления действия вируса:

1. Цшпопатическое действие вируса на культуру клеток
(ЦПД), то есть возникновение в ней видимых морфологических
дегенеративных изменений.

2. Приобретение зараженной культурой клеток способности
к гемадсорбции, т.е. к адсорбции эритроцитов на поверхности
клеточного слоя.

3. Образование в зараженной клеточной культуре под
плотным слоем специального агарового покрытия характерных
бляшек, являющихся "негативными колониями" вирусов.

Подавление процессов метаболизма в зараженной вирусом культуре клеток, выделяемое с помощью так называемой

"цветной пробы " (цветной реакции).

Эти проявления действия вирусов в клеточных культурах и являются основными критериями, с помощью которых проводят индикацию вируса, то есть выявляют его наличие, а также устанавливают количественное содержание вируса, определяя его титр.

У различных вирусов преобладают те или иные проявления действия их на клеточные культуры, что используют для предварительной идентификации вируса.

Идентификация. Окончательная идентификация

выделенного вируса проводится с помощью реакции нейтрализации с диагностическими вируснешпрализующими

сыворотками. После предварительного контакта вируса с сывороткой, этой смесью заражают культуру клеток и судят о наступившей нейтрализации, указывающей на соответствие вируса и сыворотки, по тем же критериям. Вирус, нейтрализованный специфической сывороткой:

1. Не оказывает цитопатического действия - происходит
реакция нейтрализации (торможения) цитопатического действия.

2. Не вызывает реакции гемадсорбции - наступает реакция
задержки гемадсорбции.

3. Не дает образования бляшек (или значительно
уменьшается их количество) - происходит реакция нейтрализации
образования бляшек.

4. Не вызывает подавления метаболизма клеток, что
выявляется в реакции нейтрализации по цветной пробе.

Таким путем проводят серологическую идентификацию вирусов, определяют их родовую и типовую принадлежность.

Выявление антител. По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации для определения неизвестных антител в сыворотке больного. В этом случае исследуемую сыворотку соединяют с известным вирусом, а затем вышеуказанными методами определяют - произошла ли реакция нейтрализации. Положительная реакция указывает на то, что антитела сыворотки соответствуют взятому в опыт известному вирусу.

Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток

Под цитопатическим действием понимают совокупность морфологических и функциональных (в том числе биохимических) изменений в клетках, возникающих под влиянием внедрившегося вируса.

Реакция клеток на заражение вирусом может проявляться в виде острой вирусной инфекции, латентной инфекции, трансформации клеток. Более выражена реакция клеток при острой вирусной инфекции. Предполагается, что основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведет к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий. Освобождаются и активируются клеточные ферменты (лизосомальные), которые и вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД.

При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет: клетки отслаиваются от стекла и свободно плавают в культуралъной жидкости в виде бесструктурных зерен.

Цитопатическое действие вируса на монослой клеток учитывают по четырехкрестовой системе: "++-Н-" - полная гибель клеточной культуры; "+++" - клеточный слой отсутствует, но имеются единичные клетки, не пораженные вирусом; "++" -дегенеративные изменения наблюдаются у 50% клеточной культуры; "+" - дегенеративным изменениям подверглись отдельные клетки монослоя, главным образом в краевых участках.

Симпластообразование. При острой вирусной инфекции может наблюдаться и несколько иной тип цитопатического действия - образование гигантских многоядерных клеток -симпластов (или синцитиев). Симпластообразование вызывают более 20 различных вирусов, имеющих ферменты лецитиназу, нейраминидазу и богатых лшщцами (главным образом парамиксовирусы). Ферменты воздействуют на оболочки клеток однослойной культуры, что приводит к слиянию клеток в громадные многоядерные синцитии.

Включения. К проявлению цитопатического действия вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть

едиственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса.

Латентная вирусная инфекция клеточной культуры характеризуется репродукцией вируса при отсутствии выраженного цитопатического действия.

Трансформация клеток наступает при заражении клеточной культуры онкогенными вирусами, под действием которых клетки начинают безудержно делиться и располагаются не монослоем, а растут беспорядочно в несколько слоев. При заражении такой культурой животного, у него может возникнуть злокачественная опухоль.

Индикация вируса по его цитопатическому действию, С

целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасывают культуральнуго жидкость, затем вносят но 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду (поддерживающую, без сыворотки) до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незараженными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 37°С, и ежедневно микр о скопируют с целью обнаружения ЦПД (в течение недели и более).

Дегенеративные изменения клеточного слоя не менее, чем на два креста ("++") при отсутствии таковых в незараженной культуре указывают на наличие в исследуемом материале вируса.

Цитопатическое действие различных вирусов на клеточные культуры (даже, если брать различные типы культур) обладает определенной специфичностью Родственные вирусы обычно дают цитолатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдаленных по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД нередко можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус.

Так, для энтеровирусов (вирусы полиомиелита, Коксаки, ECHO) характерно ЦПД в виде однородной мелкозернистой деструкции клеток, клетки приобретают округленную форму, располагаются довольно равномерно. Для ЦПД аденовирусов типичным является превращение клеточного слоя в скопления мелких, округлых клеток, расположенных в виде гроздьев винограда. Парагриппозные вирусы, респираторно-синцитиальный, вирусы кори и паротита дают цитопатический эффект в виде образования симплаотов.

Имеются и другие проявления цитопатического действия вирусов, не столь характерные.

Титрование вирусов по цитопатическому действию.

Количественное определение вирусов в исследуемом материале проводится с помощью титрования. Для этой цели готовят 10-кратные последовательные разведения вируса, которыми заражают клеточные культуры (берут по 4 пробирки на каждое разведение). В остальном методика титрования вируса по ЦПД не отличается от вышеприведенной методики обнаружения вируса по ЦПД.

Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине зараженных культур (т.е. в 2 пробирках из 4 с данным разведением вируса). Титр вируса вычисляется по методу Рида и Менча. Титр вируса выражают в цитопатических дозах (ЦПД₅о) в 1 мл. За одну ПДДзо принимают OJ мл вируссодержащего материала, разведенного до титра.

Идентификация выделенного вируса по нейтрализации
ЦПД. В иру ее о держащим материалом, подлежащим

идентификации, обычно служит культуральная жидкость из пробирок с клеточной культурой, давших ЦПД при заражении исследуемым материалом.

Для постановки опыта культуральную жидкость (с определенной дозой ЦПД₅о вируса) смешивают с равным объемом диагностической иммунной сыворотки (берут разведение сывортки 1:5 или 1:10). После, 1-2-часового контакта при комнатной температуре этой смесью (по 0,2 мл) заражают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предварительно была удалена питательная среда; после добавления смеси в пробирки вносят по 0,8 мл свежей среды. Обычно пробы культуральной жидкости проверяют одновременно с несколькими типовыми сыворотками. Опыт сопровождается несколькими контролями: I) контроль незараженной культуры; 2) контроль дозы вируса - клеточные культуры заражают той же дозой вируса, что и в опыте; 3) конт­роль культуры, зараженной смесью культуральной жидкости с нор­мальной сывороткой.

Опыт учитывают через 5-7 дней и более, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа. В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем - обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммунной сывороткой, т.е. сыворотка соответствует типу выделенного вируса.

Сходным образом проводят титрование

вируснейтрализующих антител в сыворотке больного. Готовят двукратные последовательные разведения исследуемой сыворотки и смешивают каждое из них со стандартной дозой известного вируса (100, 1000 ЦПД₅₀), после 1-2-часового контакта смесью заражают клеточные культуры.

Титром сыворотки называется то наибольшее разведение, которое полностью подавляет ЦПД вируса в половине взятых в опыт культур (т.е. в 2 пробирках из 4, на которых проверяют; каждое разведение сыворотки).

Реакция гемадсорбции

Гемадсорбцией называется способность культур клеток, зараженных некоторыми вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты.

Впервые это явление было обнаружено в культуре клеток, зараженных вирусом гриппа. Позже было установлено, что гемадсорбирующие свойства имеют многие вирусы (например, орто- и парамиксовирусы, флавивирусы, поксвирусы), эти же вирусы обладают способностью вызывать гемагтлютинацию -склеивание эритроцитов. Гемадсорбция и гемагглютинация имеют сходный механизм (см. главу 5). Приобретение способности к гемадсорбции связано в встраиванием в мембрану зараженных вирусом клеток (в участках будущего "почкования" вирусов) вирусспецифических белков - гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности зараженных клеток.

В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека О (I) группы.

Наиболее активными в реакции гемадсорбции являются эритроциты чувствительные к гемагглютинирующему действию данного вируса.

Обнаружение вируса в реакции гемадсорбции. Зараженные вирусом клетки приобретают способность к гемадсорбции задолго до возникновения в них цитопатических изменений, что позволяет использовать реакцию гемадсорбции для раннего обнаружения вирусов в зараженной культуре.

По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно. Латентную инфекцию культур клеток могут вызывать аденовирусы, парагриппозные, вирус герпеса и др.

Техника постановки реакции гемадсорбции._

Предварительно клеточные культуры заражают исследуемым материалом по описанной выше методике. Реакцию гемадсорбции ставят каждые два дня до появления положительной реакции (в течение 8-10 дней). Для этого в пробирку с зараженной культурой (иногда предварительно удалив среду) вносят по 0,2 мл взвеси эритроцитов (0,4%-1%) и выдерживают пробирки в наклонном положении чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем.

Температура, при которой ставят опыт, и экспозиция зависят от вида вируса. При постановке реакции с поксвирусами, вирусами клещевого энцефалита опыт проводят в течение 15-30 минут при комнатной температуре. При проведении реакции с орто- и парамиксовирусами достаточной является экспозиция в 3-5 минут.

Далее пробирки слегка встряхивают и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседания не ад сорбировавшихся эритроцитов. При микроскопии под малым увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции, выражающуюся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры, прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов.

При положительной гемадсорбции скопления эритроцитов на клетках могут быть весьма характерными. Вирус гриппа дает гемадсорбцию островкового типа: парагриппозные вирусы -диффузного; для поксвирусов характерным является расположение эритроцитов вокруг клеток в виде венчика или ожерелья.

Реакция гемадсорбции наиболее часто применяется для раннего обнаружения парагриппозных вирусов в носоглоточных смывах больных. Реакцию применяют также и для титрования вирусов и выявления специфических антител.

Идентификация вирусов в реакции задержки гелшдсорбции. Было обнаружено, что при добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно зараженной соответствующим вирусом, зараженные клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е. происходит явление задержки гемадсорбции. Вследствие специфичности этого явления, реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных.

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 5900 | Нарушение авторских прав