АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы заражения куриного эмбриона

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Этот метод является одним из наиболее употребительных. Основное преимущество его в том, что ряд вирусов при размножении на хорионаллантоисной оболочке вызывают ее характерные изменения, образуя очаги поражения в виде беловатых пятен-бляшек различной морфологии.

Для заражения используют эмбрионы 10-12-дневного возраста. Обычно к хорионаллантоисной оболочке проникают, сделав отверстие в скорлупе над воздушным мешком или же на боковой стороне яйца.

Основные этапы заражения на хорионаллантоисную оболочку со стороны воздушного пространства:

1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении
так, чтобы воздушный мешок находился наверх}'; проводят
тщательную стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.

2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы
с помощью препаровальной иглы.

3. В образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и
вырезают окно в скорлупе около 1,5см в диаметре. (При этом
нельзя допускать попадания кусочков скорлупы внутрь яйца).

4. Через сделанное отверстие виден внутренний листок
скорлупной оболочки, его осторожно надрывают глазным
пинцетом или иглой и отслаивают на небольшом участке (0,5-1
см ²), обнажив хорионаллантоисную оболочку.

5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки
путем нанесения на нее 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала
(например вируса осповакцины) с помощью пастеровской пипетки
или шприца.

6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной
пленкой, стерильным покровным стеклом или стеклянным
колпачком. Для прикрепления стекла и колпачка к скорлупе
пользуются расплавленным парафином.

Зараженные эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:

1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное
пространство было наверху, проводится стерилизация места
предстоящего вскрытия путем соответствующей обработки
спиртом и йодом.

2. Удалив пленку, покровное стекло или колпачек,
стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного
пространства.

3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку.
Обнаженную хорионаллантоисную оболочку (на которой могут
быть видимые изменения) подрезают вдоль края скорлупы. Через
образовавшееся отверстие выливают все содержимое яйца в чашку
или лоток.

4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную
оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в
стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь ее
расправляют и изучают изменения, поместив чашку на темный
фон.

Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, ее нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочную жидкость использую! в качестве вируссодержащего материала (требуется обязательная проверка на отсутствие бактериального загрязнения).

Заражение в аллантоисную полость. Этот метод

отличается своей простотой и ценен тем, что способствует значительному накоплению вируса. Для заражения обычно берут эмбрионы 10-И - дневного возраста. Основные этапы заражения в аллантоисную полость:

}. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.

2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с
помощью препаровальной иглы.

3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение
вируса (например вируса гриппа). Иглу продвигают в
вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного
мешка и затем вводят ОД-0,2 мл материала.

4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью
расплавленного стерильного парафина.

Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4°. Вскрытие производится в следующем порядке:

1.Яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют;

2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше
границы воздушного пространства.

3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупнуюоболочку, после
чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской
пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную
жидкость (ее удается набрать 5-6 мл).

4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную
пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на
бактериологическую стерильность.

Метод заражения в аллантоисную полость часто применяют для культивирования вируса гриппа, а также паротита и осповакцины.

Заражение в полость амниона

Этот метод более труден для выполнения и применяется несколько реже предыдущих. Особенностью его является то, что при заражении некоторыми пневмотропными вирусами (например, вирусами гриппа, паротита), последние размножаются не только в клетках оболочки амниона, но и в дыхательных путях и легочной ткани эмбриона, куда проникает инфицированная жидкость. Для заражения используют эмбрионы 7-12 - дневного возраста. Заражение в амниотическую полость проводят открытым методом, когда для введения материала в скорлупе делается сравнительно большое отверстие, или же закрытым методом, когда заражение производят через прокол скорлупы.

Первый из них более травматичен, второй - менее надежен, так как, действуя вслепую, не всегда удается ввести иглу в полость амниона.

Техника открытого метода заражения:

1. Яйцо помещают на подставку и проводят стерилизацию
скорлупы в области тупого конца.

2. Над центром воздушного пространства в скорлупе
ножницами вырезают окошко величиной 2 см в поперечнике (как
для заражения на хорионаллантоисную оболочку).

3. Осторожно снимают внутренний листок скорлупной
оболочки с помощью пинцета, обнажая подлежащую
хорионаллантоисную оболочку.

Прорезают ножницами небольшое отверстие в
хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной оболочки.

5. Удерживая- амниотическую оболочку в этом положении,
производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,1-
0,2 мл разведения вируса.

6. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным колпачком
или покровным стеклом, пользуясь для их фиксации и
герметизации яйца расплавленным парафином.

Зараженные эмбрионы инкубируют в течение 2 суток, выбраковывая погибшие в течение первых суток (наблюдения ведут через окошко в скорлупе). После вскрытия эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 4° С.

Техника вскрытия эмбриона при заражении в амниотическую полость:

1. Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают
скорлупу немного выше края воздушного мешка.

2. Прокалывают хорионаллантоисную оболочку
пастеровской пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость.

3. Захватив пинцетом амниотический мешок, прокалывают
его оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и
насасывают амнистическую жидкость (от 0,5 до 1,5 мл). У
зараженного эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем
как у нормального эмбриона она прозрачна.

4. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку, 0,1-
0,3 мл ее засевают в бульон для контроля на бактериологическую
стерильность.

В некоторых случаях, кроме амниотичсской жидкости, подвергают исследованию амниотическую оболочку, трахеальную жидкость и легкие эмбриона. Особенно характерны изменения цвета легких при заражении вирусом гриппа: вместо нормального бледно-розового цвета они становятся темно-красными.

Заражение в амниотическую полость является наиболее чувствительным диагностическим методом при выделении вируса гриппа.

Заражение в желточный мешок. Этот метод находит в вирусологии ограниченное применение и чаще используется для культивирования риккетсий и хламидий, при этом накопление возбудителей происходит в стенке желточного метка. Для заражения берут 5-7 - дневные эмбрионы. Метод заражения в желточный мешок напоминает по своей технике заражение в аллантоисную полость, только игла шприца вводится немного глубже.

В желточный мешок вводят 0,2-0,5 мл инфекционного материала, после чего прокол в скорлупе заливают парафином.

Зараженные эмбрионы выдерживают в термостате от 3 до 10 суток, что зависит от вида инфекционного агента. Вскрыв эмбрион, извлекают желточный мешок и подвергают его дальнейшему исследованию.

Заражение в желточный мешок применяют при культивировании вирусов лошадиного энцефалита и некоторых других.

Кроме описанных выше, существуют и другие методы заражения, используемые значительно реже. Например, иногда заражают непосредственно эмбрион, применяя внутримозговой или внутримышечный способ введения материала.

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 4498 | Нарушение авторских прав