 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Подразделение вирусов по тропизму
Обработка плотного материала, содержащего вирусы, начинается с растирания его в ступке или измельчения в специальных аппаратах гомогенизаторах. Затем готовится 10% взвесь в солевом растворе, которую центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-30 минут для осаждения крупных частиц. Вирусы остаются в надосадочной жидкости, которую и подвергают дальнейшему исследованию. Жидкий виру с со держащий материал непосредственно центрифугируют и также получают надосадочную жидкость. Уничтожение посторонней микрофлоры. Если есть сомнения в бактерияогической стерильности исследуемой вируссодержащей надосадочной жидкости, к ней добавляют антибиотики, чтобы уничтожить посторонние микроорганизмы. Антибиотики не влияют на вирусы, и они охраняют своюжизнеспособность. Применяют пенициллин и стрептомицин (200 1000 ЕД/мл) и нистатин (20 ЕД/мл). В настоящее время, в связи с большим распространением штаммов, резистентных ко многим антибиотикам, предпочитают использовать различные антибиотики широкого спектра действия и их сочетания (например тетрациклин, оксациллин, гентамицин и др.). Как правило' достаточно 30-60 минут контакта для бактерицидного действия но тем не менее, необходим посев материала на питательную среду для контроля на бактериологическую стерильность. Освобождённую от посторонней микрофлоры вируссодержащую жидкость используют для дальнейших исследований. Концентрация вирусов. Если предполагают, что исследуемый материал содержит малое количество вирусов, его подвергают предварительной концентрации путем двукратного центрифугирования: сперва при 2000-3000 об/мин в течение 20 минут осаждают крупные частицы, а затем содержащую вирусы надосадочную жидкость подвергают ультрацентрафугированию при 40000 об/мин в течение часа и получают желеобразный осадок, где сконцентрированы вирусы. Примеры взятия и обработки некоторых часто исследуемых материалов от больных вирусными инфекциями: Смыв из носоглотки. Больной прополаскивает рот (утром до приёма пищи и лекарств) стерильным физиологическим раствором или раствором Хенкса в объеме 10 мл. Смыв помещают во флакон и доставляют в лабораторию в термосе со льдом. Далее смыв центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 минут, к полученной надосадочной жидкости добавляют антибиотики, и через 30-60 минут материал готов для дальнейшего исследования. Испражнения в количестве 2-5 г помещают во флаконы, закрывают резиновыми пробками и доставляют в лабораторию в термосе со льдом. В лаборатории пробу разводят 1:10 раствором Хенкса, гомогенизируют в баночке с бусами путём встряхивания, затем проводят центрифугирование при 2000-3000 об/мин в течение 30 минут. К надосадочной жидкости добавляют антибиотики значительной концентрации. После 30-60 минутного контакта проводят высев в бульон для бактериологического контроля на стерильность. До получения ответа надосадочную жидкость сохраняют в замороженном состоянии, а затем используют её для выделения вируса. Методы очистки вирусов Для проведения некоторых вирусологических исследований, например, электронномикроскопмческих. а также для изучения физико-химических свойств вирусов, необходимо иметь их высоко очищенные препараты, не содержащие посторонних примесей. Такой очистке подвергают вируссодержащие материалы, предварительно сконцентрированные путём двукратного центрифугирования при различных скоростях. Дополнительную очистку осуществляют различными физико-химическими методами. Дифференциальное центрифугирование. Метод разделения частиц разных размеров по различной скорости их осаждения. При этом методе многократно чередуется малая (2000-3000 об/мин) и большая (40000-50000 об/мин) скорости центрифугирования вируссодержащего материала. Вирус оказывается то в надосадочной жидкости (при малых скоростях), то в осадке (при больших скоростях), который ресуспензируют и снова подвергают центрифугированию. Таким путём достигают высокой степени очистки вируса. Центрифугирование в градиенте плотности. Применяют для очистки вирусов и определения их плотности. При этом методе в центрифужную пробирку слоями наливают растворы вещества (например, сахарозы), имеющие разную плотность, причём самую высокую плотность (выше, чем ожидаемая плотность вируса) создают на дне пробирки, к поверхности плотность постепенно убывает. Очищаемую вируссодержащую взвесь наслаивают сверху. Во время центрифугирования частицы различных плотностей распределяются в разных слоях раствора в виде отдельных зон. Вирусы, имеющие определённую плотность, отличную от плотности тканевых частиц, распределяются в одной из зон и могут быть выделены в чистом виде. Фильтрование вируссодержащей жидкости через колонки, заполнение сефадексом (декстриновый гель). Разделяющие свойства такой колонки основаны на том, что частицы разной величины проходят через неё с различной скоростью, причём крупные быстрее мелких. Собирая отдельные порции фильтрата, в одной из них получают очищенный вирус. Адсорбция вирусов на различных адсорбентах последующей элюцией. Подобрав определённые условия, удаётся сорбировать вирус на некоторых веществах (ионообменных смолах, бентионите, гипсе и др.), а затем извлечь их (элюция), при этом примеси остаются на адсорбенте, а в растворе оказывается очищенный вирус. Применяют и другие методы очистки, например, осаждение вирусов алкоголем, высаливание и др. Если необходима дальнейшая очистка вируса или нужно изучить составляющие его компоненты, применяют различные методы фракционирования, то есть разделение изучаемого препарата вируса на несколько фракций, после чего исследуют каждую из них отдельно. Для фракционирования используют электрофорез, хроматографию, ионообменные смолы. Ультрафилътрация. Долгое время ультрафильтрация через специальные мелкопористые фильтры различных типов (керамические или "свечи", пластинчатые - асбестовые и мембранные) была основным способом очистки виру с содержащих материалов от других микроорганизмов и других посторонних частиц. Однако, ввиду больших потерь вирусов вследствие адсорбции вирусов на фильтрах и забивании их пор фильтруемыми частицами, а также значительной трудоёмкости этого метода, в настоящее время ультрафильтрацию как способ очистки вируссодержащего материала почти не применяют. .Методы ультрафильтрации используют в вирусологической работе, главным образом, для "холодной" стерилизации различных растворов, питательных сред, сывороток и других жидкостей, не переносящих воздействия повышенных температур. При этом следует помнить, что данный способ стерилизации не вполне надёжен, так как ультрафильтры пропускают объекты малых размеров (вирусы, зернистые элементы L-форм и микоплазм и др.). Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 2931 | Нарушение авторских прав |