АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Электронная микроскопия

Применение электронного микроскопа чрезвычайно расширило наши знания в области морфологии и улътраструктры вирусов, позволило изучить закономерности взаимодействия вируса и клетки, этапы морфогенеза вирусов в процессе их
репродукции. Электронноскопию и, особенно,

иммуноэлектронноскопию применяют при диагностике некоторых вирусных инфекций.

Электронноскопические препараты. Их готовят из очищенных и концентрированных вируссодержащих взвесей или ультратонких срезов тканей, заражённых вирусами. Вирусные объекты наносят на специальные плёнки-подложки, помещённые на опорные сеточки. Плёнки-подложки должны быть очень тонкими (не более 30 нм толщины), прозрачными и достаточно прочными. Хорошо себя зарекомендовали коллоидийно-уголъные плёнки. Плёнки наносят на поддерживающие сеточки из меди (диаметром 2-3 мм) с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различнъми способами, которые приведены ниже.

Методы напыления металлами (теневой обработки), Применяют для получения контрастных препаратов. Пары тяжёлых металлов (золота, платины, урана и др.), образующиеся в специальном приборе в условиях вакуума и высокой температуры, направляют под острым углом на вируссодержащий препарат. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла, за исключением стороны, закрытой объектом, что создаёт эффект отбрасываемой тени. Метод напыления создаёт объёмность изображения, позволяет хорошо изучить форму и величину вирионов, строение их поверхности. Но внутренняя структура вируса недоступна для наблюдения.

Метод негативного контрастирования. Наиболее часто
применяемый метод получения контрастных препаратов,

позволяющих выявлять как строение поверхности вирионов, так и их внутреннюю структуру. Принцип этого метода основан на том, что при обработке препарата некоторыми солями тяжёлых металлов, например, 1-2% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, создаётся более плотный слой, не пропускающий электроны, на котором хорошо видны более электроннопрозрачные исследуемые объекты.

Кроме негативного контрастирования применяют также метод позитивного контрастирования, при котором соли тяжёлых металлов, например, 1-2% раствор уранил-ацетата, соединяясь с веществами, входящими в состав вирионов, как бы "окрашивают" их, в результате чего на светлом фоне видны более тёмные вирусные структуры.

Метод ультратонких срезов в сочетании _с негативным контрастированием. Является наилучшим для изучения тонкого строения вирионов и изучения этапов взаимодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наиболее сложен. Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вируссодержащего материала фиксируют в специальном фиксаторе (например, осмиевом). Обезвоживают путём последовательного помещения в спирты возрастающей крепости. Заливают образцы специальной пластмассой, после полимеризации которой образуются твёрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщиной 10-20 нм на специальном микротоме. Полученные срезы контрастируют, помещая в раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты или уранил-ацетата.

Приготовленные вышеописанными способами препараты изучают в просвечивающем электронном микроскопе, разрешающая способность которого достигает 0,2-0,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюоресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют специальные фотопластинки, с которых получают отпечатки. Получаемые увеличения: х!00000-х400000.

Сканирующая электронная микроскопия. Осуществляется с помощью сканирующего (растрового) электронного микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излучение вторичных электронов, которое, прохода через катодно-лучевую трубку, преобразуется в объёмное изображение объекта на флюоресцирующем экране {процесс сходен с формированием телевизионного изображения).

Сканирующая микроскопия позволяет получать трёхмерные изображения вирионов (предварительно препарат напыляют металлами), различать детали строения их поверхности, но не выявляет их внутреннюю структуру. Разрешающая способность сканирующего микроскопа равна 7-20 нм.

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 1264 | Нарушение авторских прав