АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Метод бляшек

Бляшками называются округлые участки разрушенных по действием вируса клеток однослойной культуры. Это своеобразные "негативные колонии" вирусов, образовавшиеся на месте попадания одного вириона.

Для получения бляшек клеточный монослой заражают небольшой концентрацией вируса и фиксируют адсорбировавшиеся на клетках вирионы с помощью агарового покрытия, в которое добавлен витальный краситель - нейтральный красный. В таких условиях ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать нейтральный красный и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появляются бляшки в виде более прозрачных неокрашенных округлых пятен.

Одним из первых были получен бляшки вирусов полиомиелита в однослойной культуре клеток, выращиваемой в чашках Петри с подачей стерильного воздуха с 3% СО₂ (Дюльбекко, 1962г.)

В настоящее время бляшки получают, выращивая культуру клеток в обычном термостате в плоских флаконах-матрацах, закрытых резиновыми пробками, иногда в чашках Петри, герметизированных лейкопластырем.

Покровная среда. Агаровое покрытие готовят из высококачественного агара в концентрации 1-1,5% и других компонентов - солевых буферных растворов, дополнительных питательных факторов, антибиотиков. Раствор нейтрального красного входит в состав среды или его добавляют во флакон или чашку незадолго до учета опыта. Существуют различные рецепты покровных сред, применяемые с учетом типа клеточной культуры и вируса.

В последнее время хорошо зарекомендовали себя покровные среды, в которых вместо агара используют гель бентионита (5-6%).Это алюмосиликат природного происхождения, который биологически инертен и не токсичен для культур клеток. Под бентионитовым питательным покрытием бляшки хорошо выявляются.

Обнаружение и титрование вирусов методом бляшек. Для
получения бляшек вирусов во флаконы или чашки наливают взвесь
клеток в питательной среде (№ 199 или среда с гидролизатом
лактальбумина). Флаконы закрывают резиновыми пробками,
чашки заклеивают лейкопластырем и помещают в термостат на 5-6
дней для получения монослоя клеток, который должен быть
сплошным, без признаков дегенерации. Перед заражением среду из
флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток
осторожно отмывают раствором Хенкса, который затем тщательно
отсасывают. Заражение производят путем внесения разведенного
исследуемого материала в объеме 0,1-0,25 мл равномерного
распределения этого материала по поверхности клеточного слоя с
помощью покачивания. Через 30-60 минут зараженную культуру
клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашки с
застывшей средой помещают в термостат (клеточным слоем
кверху) и выдерживают до образования бляшек (2-5 суток), после
чего производят их подсчет и изучение. Существует
пропорциональная зависимость между разведением

вируссодержащего материала и количеством образовавшихся бляшек, позволяющая считать, что каждая бляшка образуется в результате размножения в клетках одного вириона.

Способность к образованию бляшек в настоящее время обнаружена у многих вирусов: полиомиелита, Коксаки, ECHO, энцефалита, гриппа, кори и ряда других.

При изучении морфологии бляшек установлено, что разные вирусы, как правило, образуют бляшки, отличающиеся по величине, форме, характеру краев, по срокам появления и другим свойствам, что может быть использовано для предварительной идентификации вируса.

Наиболее часто метод бляшек применяют для титрования вирусов. Для этой цели приготовляют серийные разведения вирусе од ержащего материала и каждое из разведений вносят во флакон или чашку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляшки (с учетом разведения вируса) вычисляют титр вируса - количество вирионов в 1,0 мл, исходного материала. Титр вируса, определяемый методом бляшек, принято выражать числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Идентификация вирусов и титрование антител. Метод бляшек дает возможность провести точную идентификацию вируса с помощью диагностических специфических сывороток. При соответствии между сывороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при заражении монослоя клеток такой смесью бляшки не образуются или их количество значительно снижается. Благодаря своей чувствительности и точности метод приобрел большое значение в изучении тонких антигенных различий у вирусов.

С помощью метода бляшек удается также обнаружить антитела в сыворотке больных и определить их титр, что имеет диагностическое значение. За титр сыворотки принимают ее наибольшее разведение, снижающее количество бляшек на 50%.

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 3229 | Нарушение авторских прав