АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Реакция нейтрализации in vivo

Реакция нейтрализации вирусов высоко специфична, она широко применяется для установления диагноза вирусных инфекций, а также для титрования коммерческих препаратов противовирусных иммунных сывороток и иммуноглобулинов.

Реакция нейтрализации основана на способности иммунной вируснейтрализующей сыворотки при контакте с вирусом подавлять его инфекционные свойства, что выявляется при введении смеси в чувствительную биологическую систему (мыши, куриные эмбрионы, клеточная культура).

Мы уже ознакомились с применением реакции нейтрализации вирусов в клеточных культурах (нейтрализация ЦПД, задержка гомадсорбции, нейтрализация по цветной пробе задержка образования бляшек), а такие при постановке реакции торможения гемагтантинации. Здесь рассматривается постановка этой реакции на мышах и куриных эмбрионах.

Основными составляющими компонентами этой реакции являются: иммунная вирус нейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сыворотки одного и того же вида животного или человека: содержащий живые вирусы материал, являющийся антигеном, и биологические объекты (мыши, куриные эмбрионы), на которых обнаруживают вируснейтрализующее действие иммунной сыворотки.

Применяют два варианта постановки реакции нейтрализации. При одном из них берут постояшгую дозу сыворотки и различные разведения вируса, при втором - постоянное разведение вируса и различные разведения сыворотки.

Первый вариант используют, когда необходимо установить, при каком разведении вируса наступает нейтрализующее действие сыворотки. Второй вариант выявляет нарастание титра антител. В зависимости от задач исследования и свойств вируса методы и объекты заражения и сама методика постановки реакции нейтрализации могут быть различными, однако это не меняет сущности реакции. Во всех случаях последовательность проведения реакций следующая:

1). предварительный контакт вируссодержащего материала с соответствующей иммунной сывороткой (один на этих компонентов заведомо известен, наличие другого определяется);

2). введение этой смеси в чувствительную биологическую систему (белым мышам или куриным эмбрионам);

3). учет наличия или отсутствия нейтрализации.

Сыворотки, употребляемые для реакции нейтрализации. получают либо от больных людей (для обнаружения антител и нарастания их титра), либо применяют диагностические сыворотки от иммунизированных животных (для идентификации возбудителя).

Перед постановкой реакции сыворотки, как правило, инактивируют, прогревая при температуре 56 - 60 С.

Антигены (вирусосодержащие взвеси) получают из материала от больных вирусными инфекциями, готовят из органов и тканей зараженных вирусом животных, куриных эмбрионов, а также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением антиген титруют для определения его активности.

Биологические объекты, употребляемые в реакции нейтрализации являются той средой, в которой проявляется нейтрализующее вирус действие иммунной сыворотки. Поэтому выбор того или иного объекта производится о учетом свойств вируса, чувствительности самого объекта к действию вируса, а также задач и условий исследования. В качестве биологических объектов используют лабораторных животных, чаще всего белых мышей, куриные эмбрионы, а также культуры клеток (см. главу 4).

При работе с вирусами необходимо учитывать их тропизм, что позволяет значительно повысить чувствительность реакции нейтрализация и выявлять ничтожные количества антител. Можно вводить вирус и без учета его избирательных свойств к ткани, однако в этом случае надо выбирать объект более чувствительный к данному вирусу, например новорожденных животных.

Постановка реакции нейтрализации. Работа со всеми ингредиентами реакции нейтрализации и ее постановка проводится с соблюдением всех правил асептики.

/ вариант. Чаще его ставят для идентификации выделенного вируса. Для постановки реакции берут два ряда пробирок, из которых первый ряд является олытным, а второй - контрольным. В первый ряд пробирок наливают определенное количество неразведенной диагностической иммунной сыворотки, во второй -контрольный - такое же количество неразведенной нормальной сыворотки того же.вида животного. Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при добавлении их в пробирки опытного к контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10"', 10'², 10"³ и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объемах, например по 0,2 мл. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 37 С обычно на 1-2 часа. После этого опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы.

Каждым разведением для достоверности опыта заражают пе менее 4 мышей или куриных эмбрионов.

Реакция нейтрализации на белых мышах (1 вариант).

За зараженными животными (опытными и контрольными) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, регистрируют заболевших и погибших мышей. Учет реакции проводят путем сопоставления количества погибших опытных и контрольных мышей от соответствующего разведения вируса. Определяют 50 % смертельную дозу - LD₅o, проводя подсчет по Риду и Менчу. Высчитывают индекс нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой (стр. 68).

Реакция нейтрализации на куриных эмбрионах (1 вариант). Подготовительная работа для этой реакции описана выше. Введение смеси вируса с иммунной сывороткой в куриные эмбрионы следует проводить, учитывая тропизм вируса. Так, вирус гриппа вводят в амниотическую или аллантоисную полость куриного эмбриона; вирус герпеса, осповакцины наносят на хорионаллантоисную оболочку и т.д. Зараженные эмбрионы инкубируют при температуре 35-37° С от 48 до 72 ч. Затем яйца вскрывают, аллантоисную или амниотическую жидкость отсасывают и в ней определяют наличие вируса при помощи реакции гемагглютинации. Если гемагглютинация наступила в контроле (смесь нормальной сыворотки о разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрализующим действием. Конечный титр вируса в контроле и в опыте определяют путем статистической обработки.

II вариант (на мышах и куриных эмбрионах). Реакцию ставят с различными разведениями исследуемой сыворотки и достоянной дозой известного живого вируса. Для этого к двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объемы определенного разведения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD₅o вируса). Далее поступают как и в 1-м варианте, то есть выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате, после чего вводят их мышам или куриным эмбрионам.

При постановке реакции нейтрализации на мышах за титр изучаемой сыворотки принимают разведение, дающее защитный эффект у 50% мышей.

В реакции на куриных эмбрионах титром сыворотки считается то наибольшее ее разведение, которое еще способно задерживать гемагглютинирующее действие вирусов у 50% зараженных куриных эмбрионов.

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 6951 | Нарушение авторских прав