Б. Определение группы крови с помощью цоликлонов (моноклональных антител)
Используются стандартные наборы моноклональных антител высокой специфичности, содержащие реагенты (цоликлоны) анти-А, анти-В и анти-АВ. Для каждого определения группы крови достаточно применять по одной серии реагентов (цоликлонов) анти-А и анти-В.
На маркированную пластинку капают в три точки, исследуемые эритроциты (0,02 мл). Рядом с ними, под соответствующими надписями, помещают цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной капле (0,1 мл) в соотношении 1:5... 1:6. После смешивания реагентов и крови стеклянными палочками (уголками предметных стекол), пластинку периодически покачивают, ход реакции наблюдают в течение 3 мин.
Оценка результата проводится по наличию агглютинации эритроцитов с соответствующим реагентом.
Возможны четыре варианта определения результатов:
а) Агглютинация во всех трех каплях цоликлонов – это значит, что исследуемые эритроциты содержат оба антигена (А и В) и кровь принадлежит к группе АВ (IV). В целях исключения панагглютинации, которая может наблюдаться у отдельных больных (миеломная болезнь, ожоговая болезнь), а также в пуповинной крови новорожденных, в случае установления группы крови АВ (IV) необходимо провести контрольное исследование: одну каплю (0,1 мл) изотонического раствора натрия хлорида смешать с маленькой каплей (0,01 мл) исследуемой крови. Реакция агглютинации должна отсутствовать.
б) Агглютинация с цоликлонами анти-А и анти-АВ – это означает, что исследуемые эритроциты содержат только антиген А и кровь принадлежит к группе А (II).
в) Агглютинация с цоликлонами анти-В и анти-АВ – это означает, что исследуемые эритроциты содержат только антиген В и кровь принадлежит к группе В (III).
г) Агглютинация отсутствует во всех трех каплях цоликлонов - это значит, что исследуемые эритроциты не содержат антигенов А и В, и кровь принадлежит к группе 0(I).
Оценка результатов определения групп крови при помощи цоликлонов приведена в таблице:
Группа крови
| цоликлон «анти-A»
| цоликлон «анти-B»
| цоликлон «анти-АВ»
| 0(I)
| -
| -
| -
| A(II)
| +
| -
| +
| B(III)
| -
| +
| +
| AB(IV)
| +
| +
| +
| Знаком (+) обозначено наличие агглютинации, знаком (-) ее отсутствие.
При наличии агглютинации со всеми тремя реагентами (цоликлонами) необходимо исключить неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого, ещё одну каплю эритроцитов смешивают с каплей физиологического раствора. Кровь можно отнести к группе AB(IV) только при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.
Подробные сведения по вопросу «Определение группы крови системы АВО цоликлонами»
Цоликлоны изготавливают из водяночной (асцитной) жидкости лабораторных мышей – носителей «анти – А» и «анти – В» гибридом.
Цоликлон «анти – А» (красного цвета) представляет собой раствор антител «анти – А».
Цоликлон «анти – В» (синего цвета) представляет собой раствор «анти – В».
Цоликлон «анти – АВ» (неокрашенный)представляет собой смесь растворов антител «анти – А» и «анти – В» и предназначен для дополнительного контроля группы крови О(I).
Срок хранения - 2 года при температуре +2°…+6°
Вскрытый флакон можно хранить в закрытом виде при температуре +20…+60 в течение 21 дня (дату вскрытия флакона обязательно пишут на его этикетке).
Цоликлоны предназначены для определения групп крови человека системы АВ0 в реакциях гемагглютинации, они применяются взамен стандартных иммунных сывороток и параллельно с ними.
Цоликлоны предназначены для выявления в эритроцитах человека антигенов системы АВ0. Анализ может проводиться с кровью, как взятой в консервант, так и без консерванта, а также и с капиллярной кровью, взятой из пальца. Технология изготовления цоликлона исключает возможность его заражения патогенными для человека вирусами.
Определение группы крови проводится в помещении с хорошим освещением при температуре +150…+250 на пластинке светлого однотонного цвета с чистой сухой обезжиренной поверхностью (возможно использование планшетов для определения групп крови). Также необходимы:
- одноразовые пастеровские пипетки для нанесения на пластинку капель исследуемой крови;
- палочки стеклянные (предметные стёкла) для смешивания цоликлонов с исследуемой кровью;
-пробирки с исследуемой кровью (в штативе).
Проведение исследования. Оценка результата:
Нанесите на планшет (пластинку) индивидуальными пипетками цоликлоны «анти–А», «анти–В» и «анти–АВ» по одной большой капле (0,1мл) под соответствующими надписями (при использовании неградуированных пипеток, 0,1мл – это одна полная капля).
Рядом с каждой каплей раствора антител нанесите маленькую (0,02мл) каплю исследуемой крови. Соотношение «цоликлон: кровь» соответствует соотношению «5:1». Смешайте каждую каплю цоликлона с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой. Наблюдайте за ходом реакции с цоликлонами, при лёгком покачивании пластинки (планшета). в течение 3 минут. Агглютинация эритроцитов цоликлонами обычно наступает в первые 3–5 секунд, но наблюдение следует вести 3 минут, ввиду более позднего появления агглютинации эритроцитов, содержащих слабые разновидности антигенов А или В.
Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным.
Положительный результат выражается в склеивании (агглютинации) эритроцитов. Агглютинаты видны невооружённым глазом в виде мелких красных зёрнышек, песчинок, быстро сливающихся в крупные хлопья, а капля быстро просветляется.
При отрицательной реакции, гемагглютинация не развивается, капля остаётся равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты (зёрнышки, песчинки, хлопья) в ней не обнаруживаются.
Объяснение результатов реакции исследуемой крови с цоликлонами представлено в таблице.
Результаты реакций с цоликлонами
| Исследуемая кровь принадлежит к группе
| контроль
| цоликлон
| цоликлон
| цоликлон
| физраствор
(соответствует сыворотке IV группы)
| "анти – А"
(соответствует сыворотке III группы)
| "анти - В"
(соответствует сыворотке II группы)
| "анти - АВ"
(соответствует сыворотке I группы)
|
| -
| -
| -
| ОI
|
| +
| -
| +
| А(II)
|
| -
| +
| +
| В(III)
| -
| +
| +
| +
| АВ (IV)
| | | | | | | | Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации.
Знаком минус (-) обозначено отсутствие агглютинации.
При положительной реакции агглютинации со всеми тремя цоликлонами, необходимо исключить неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов.
Для этого необходимо отдельно смешать одну большую (0,1мл) каплю физиологического раствора с маленькой (0,05–0,01мл) каплей исследуемой крови.
Кровь можно отнести к группе АВ(IV) только при отсутствии агглютинации исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе.
При наличии агглютинации, при этом контрольном исследовании, заключение о групповой принадлежности крови не делают, образец крови направляют в специализированную лабораторию.
Окончательно, групповую принадлежность крови (в системе АВ0) устанавливают в лаборатории перекрёстным способом – по результатам перекрёстного определения: антигенов А и В на эритроцитах, антител « анти–А» и «анти–В» в сыворотке.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1954 | Нарушение авторских прав
|