АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Перекрестный метод (метод стандартных эритроцитов)

Второй этап определения группы крови проводится в лаборатории из доставленной про­бирки перекрестным методом, т.е. одновременно при помощи стандартных сывороток и стан­дартных эритроцитов. Резус-принадлежность эритроцитов определяется в соответствии с требованиями действующей «Инструкции по определению резус-принадлежности крови». Полученные лабораторный анализ с указанием групповой и резус-принадлежности при совпадении всех паспортных данных, номера медицинской карты, результатов определения группы крови после свер­ки с первоначальными данными вклеивается в медицинскую карту.

При определении группы крови в лаборатории перекрестным методом (одновременно при помощи стандартных сывороток и эритроцитов) разрешается проводить исследование по одной серии сыворотки, если титр используемой сыворотки не ниже, чем 1:64.

Способ наиболее часто используется в серологических лабораториях.

Суть метода состоит в определении наличия шли отсутствия в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител а и ß с помощью стандартных эритроцитов. Это дает полную серологическую характеристику крови.

Реакция со стандартными эритроцитами проводится следующим образом.

Необходимое оснащение:

- Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для реакции агглютинации необходимы стандартные эритроциты трех групп крови: О(I), А(II), В(III).

- Стандартные эритроциты приготавливают из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при 4-8°С. Срок годности 2-3 дня.

Техника проведения реакции:

- Кровь для исследования берут из вены в сухую пробирку, центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 минут для разделения на сыворотку и эритроциты.

- На маркированную тарелку пипеткой в шестъ ячеек наносят по одной большой капле сыворотки исследуемой крови из пробирки (0,1мл), а рядом с ними — по одной маленькой капле (0,01мл) стандартных эритроцитов групп О(I), А(II), В(III) (по две серии).

- Дальнейшие мероприятия проводятся аналогично методу с использованием стандартных изогемагглютинирующих сывороток: соответствующе капли смешивают стеклянными палочками, планшет покачивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего оценивают результат.

Реакция со стандартными сыворотками проводится описанным выше способом параллельно с реакцией со стандартными эритроцитами.

Трактовка результатов

При трактовке результатов оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартным изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами (Схема3).

Особенностью трактовки результатов реакции со стандартными эритроцитами является то, что эритроциты группы 0(I) являются контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).

Результат перекрестного способа считается достоверным только если при оценке результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать.

Схема 3.

+ -агглютинация, - - нет агглютинации.

Возможные ошибки.

Определение групповой принадлежности с помощью реакции агглютинации может сопровождаться ошибками, которые ведут к неверной трактовке результатов. Все ошибки можно разделить на три группы: низкое качество реагентов, технические ошибки, особенности исследуемой крови.

Низкое качество реагентов

Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки и стандартные эритроциты могут иметь низкие агглютинабельные свойства, что приводит к неверному толкованию результатов реакции. Во избежание подобных ошибок следует следить за сроком годности реагента, условиями хранениями, а также их внешним видом (прозрачность сыворотки, отсутствие пленок, хлопьев, запаха гниения и пр.).

Технические ошибки

Ошибки технического характера связаны с несоблюдением или недостаточно точным выполнением всех правил проведения реакции.

а) Несоблюдение внешних условий:

- Плохая освещенность мешает обнаружить агглютинацию или ее отсутствие.

- Повышение температуры свыше 25°С резко замедляет агглютинацию.

- При низкой температуре (менее 15°С) может произойти неспецифическая агглютинация независимо от состава агглютининов и агглютиногенов, так называемая холодовая панагглютинация (агглютинация отмечается при реакциях с сыворотками всех групп крови). Это явление происходит за счет наличия в сыворотке особого холодового агглютинина, который может давать реакцию агглютинации только при низких температурах.

б) Неправильное проведения самой реакции.

- Нарушение расположения сывороток, соотношения сыворотки и крови, слияние соседних капель и пр. создают возможность неправильной интерпретации полученных результатов.

- Ранняя оценка результатов также может привести к ошибке, особенно при наличии подтипа антигена А (слабого антигена А₂), дающего позднюю агглютинацию.

в) Недобавление физиологического раствора.

- Несоблюдение этого простого правила (в капли, где произошла агглютинация, следует добавить изотонический раствор хлорида натрия) может привести к тому, что за специфическую агглютинацию будет принята ложная (псевдоагтлютинация).

Под термином псевдоагглютинация подразумевают способность эритроцитов склеиваться в монетные столбики или кучки с сохранением мембран, независимо от их агглютинабельных свойств. Границы между форменными элементами хорошо видны под микроскопом, в отличие от истинной агглютинации, при которой происходит разрушение мембран эритроцитов. Добавление 1-2 капель изотонического раствора хлорида натрия позволяет дифференцировать истинную агглютинацию от ложной. Псевдоагглютинация расходится довольно быстро, в то время как истинная агглютинация сохраняется прежней или становится более выраженной.

г) Особенности исследуемой крови.

- Развитие неспецифической панагглютинации может быть связано не только с низкой температурой, но и с качествами самой крови.

Панагглютинацию при бактериальном заражении исследуемой крови в 1927 г. описал Томсен. Этот феномен (феномен Томсена) характеризуется агглютинацией крови с сыворотками всех групп и сывороткой собственной крови. Подобное явление неспецифической агглютинации может наблюдаться и в свежей крови, но оно встречается довольно редко и носит название панагглютинации или аутоагглютинации. Сущность явления заключается в том, что сыворотка при комнатной температуре дает агглютинацию со всеми эритроцитами, даже со своими собственными (аутоагглютинация), а эритроциты в то же время дают агглютинацию со всеми сыворотками, даже с сывороткой группы АВ(IV).

Подобное явление описано при ряде заболеваний: болезнях крови, спленомегалии, циррозе печени, инфекционных заболеваниях и т. д. Описана панагглютинация и у здоровых людей, но крайне редко (0,07%). Явления панагглютинации и аутоагглютинации наблюдаются только при комнатной температуре; при температуре, близкой к температуре человеческого тела, они обычно не выявляются.

Во избежание ошибок необходимо не допускать определение группы крови при температуре ниже 15°С. Если при определении групповой принадлежности агглютинация наблюдается с сыворотками групп 0(I), А(II) и В(III), всегда следует проводить реакцию с сывороткой группы АВ(IV). И только тогда, когда в этой капле не будет агглютинации, можно исключить панагглютинацию и отнести кровь к группе АВ₀(IV). При наличии агглютинации с сывороткой АВ(IV) необходимо подогреть кровь до 37°С и вести реакцию при этой температуре.

Панагглютинация и аутоагглютинация исчезают, если определение групповой принадлежности проводить при 37°С.

При некоторых заболеваниях отмечается снижение агглютинабельности агглютиногенов эритроцитов (хронические инфекционные заболевания, онкологические заболевания, болезни крови и пр.). При этом так же, как и при наличии слабого антигена А₂, следует четко соблюдать условия и время реакции.

Во всех случаях нечеткого или сомнительного результата необходимо повторное определение групп крови при помощи стандартных сывороток других серий, а также перекрестным способом!

III. Методы определения резус-фактора:

Все способы определения резус-фактора можно разделить на две группы: методы, которыми определяют кровь в клинике, и методы применяемые в лаборатории.

В клинике используются два так называемых экспресс-метода:

• Экспресс-метод со стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева.

• Экспресс-метод на плоскости без подогрева.

Экспресс-метод определения резус-фактора стандартным универсальным реагентом для определения резус-фактора – Rh0 (D) в пробирках без подогрева.⁵

Оснащение:

- специально приготовленный универсальный реагент антирезус,

- стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты для контроля,

- пробирки,

- пипетки Пастера,

- изотонический раствор NaCl.

Для определения резус-фактора может быть использована свежая несвернувшаяся кровь, взятая из пальца непосредственно перед исследованием, или консервированная без всякой предварительной обработки, и также эритроциты из пробирки после образования сгустка и отстаивания сыворотки.

Техника определения:

На дно пробирки внести 1 каплю стандартного реагента антирезус и 1 каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Содержимое пробирки перемешать встряхиванием и затем медленно поворачивать, наклоняя пробирку почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по ее стенкам. Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной. Как правило, агглютинация наступает в течение одной минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген + антитело и четко выраженной агглютинации, а также ввиду возможности замедленной реакции при слабо выраженной агглютинабельности эритроцитов контакт эритроцитов с реагентом при перевертывании пробирки следует проводить не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавить 2-3 мл изотонического раствора NaCl и перемешать, не взбалтывая, путем 2-3-кратного перевертывания пробирки. Оценку производить визуально.

Одновременно с исследованием крови больных или доноров производится контрольное исследование стандартных резус-положительных эритроцитов той же группы или группы 0(I) по системе АВО и стандартных резус-отрицательных эритроцитов, обязательно одногруппных с исследуемой кровью.

Оценка результатов:

Наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветленной жидкости указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови (Rh+).

Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная жидкость) указывает на резус-отрицательную принадлежность исследуемой крови (Rh-).

Результат учитывается как истинный после проверки контрольных образцов, т.е. при положительном результате со стандартными резус-положительными эритроцитами и отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, одногрупными с исследуемой кровью по системе АВО.

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 3116 | Нарушение авторских прав