АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

СОЦИАЛЬНАЯ ГЕРОНТОЛОГИЯ 6 страница

Зерттелетін үлгілердегі С3 құрамы құрамында белгілі концентрацияда С3 болатын стандарттардың бақылау араласпаларына байланысты анықталады.

Нәтижелерді есептеу:

· бинокулярлық лупаның (МБС-9 немесе 10) көмегімен преципитаттың диаметрі өлшенеді;

· преципитат диаметрінің С3 концентрациясына байланысының калибрлік қисығы сызылады. Абсцисс осіне преципитаттар сақиналарының диаметрі (мм), ординат осіне С3 концентрациясы белгіленеді. Пайда болған нүктелер байланыстырылады. Ізделіп отырған үлгілерде С3 анықтау үшін абсцисс осіне зерттелтін үлгілердің преципитат сақыналары қойылады, стандартты калибрлік қисықпен қиылысқанға дейін сызық жүргізіледі, қиылысу нүктесі ординат осіне белгіленіп, үлгілердегі С3 концентрациясы анықталады.

Сапаны бақылау.

Алдын ала жасалған Шухарт картасына С3 бақылау көрсеткіштері (г/л) бейнеленеді.

Тәжірибелік сабақ 8

ТАҚЫРЫП: Бейспецификалық қорғаныс факторлары. Фагоцитоз. Бағалау әдістері. Хемилюминесценция.

Сабақтың жоспары:

1. Фагоцитоз. Фагоцитоздың кезеңдері. Метаболиздік жарылудың механизмдері.

2. Хемилюминесценция әдісінің принципі.

3. Реактивтерді дайындау.

4. Жабдықтарды және қосымша материалдарды дайындау.

5. Зерттеуге арналған үлгілерді дайындау.

6. Зерттеу техникасы.

7. Нәтижелерді есептеу.

8. Сапаны бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· тапсырмаларды орындау үшін алдыңғы сабақтарда алған теориялық білім мен тәжірибелік дағдыларды пайдалану қажет;

· жатыр және ФМА, люминолдан жұмыс ерітінділерін дайындай білу;

· ХЛ 1251 бағдарламасымен жұмыс жасай алу;

· жасушалардың (нейтрофилдердің) суспензияларын бөліп ала білу;

· бақылау және зерттеу үшін сынамаларды дайындай және қолдана білу;

· ХЛ анализаторына сынамаларды енгізе білу;

· әдістің сапасын бақылаудың негіздерін білу және жүргізе алу;

· зерттеу нәтижелерін дұрыс жасай білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Фагоцитоз организмнің ең негізгі де маңызды қорғаныс факторы болып табылады, ол адгезияны, жұтуды, қорытуды іске асырады және генетикалық бөгде денелерді гидролиздейді. Аяқталған фагоцитоз толық гидролиздеумен бітеді, ал аяқталмаған фагоцитозда толық жойылмаған антиген толыққанды спецификалық иммунологиялық реакцияны түзе алады. Фагоцитоз микробтарға, қатерлі ісіктерге қарсы, трансплантациялық иммунитеттің, иммунологиялық төзімділіктің түзілуінде өте маңызды болып есептеледі.

Жасушалардың фагоциттік белсенділігін бағалаудың бірнеше әдістері бар. Біз олардың екеуіне тоқталамыз: хемилюминесценция әдісімен фагоцитозды бағалау және нитро-көк тетразолийдің қалыптасу сынамасында нейтрофилдердің жалпы тотығу-тотықсыздану белсенділігін анықтау.

Әдістің принципі.

Белсенген нейтрофилде (антигеннің қорытылу процесі) күшті метаболиздік өзгерістер жүреді, химиялық белсенділік, мембрана компоненттерінің тотығуы жоғарылайды; қуат бөлінеді, хемилюминесценция жүреді – «метаболизмдік жарылу». Оттегі метаболиттерінің әсерінен тотығатын люминол хемилюминометрде тіркелетін жарық қуатын генерациялайды.

Белсенді оттегінің метаболиттер жүйесі нейтрофилдердің бактерицидтеу механизмінде негізгі орынды иелейді. Нейтрофилдерді хемилюминесценциялау әдісі нейтрофилдердің оттегі тәуелді бактерицидті жүйесінің жағдайын бағалау үшін қолданылады.

Анализде ЭДТА антикоагулянты бар пробиркаға алынған қан пайдаланылады.

Реактивтер мен жабдықтар:

· бағдарламамен қамтамасыздандырылған LR 1251 хемилюминометрі;

· ХЛ арналған арнайы пробиркалар;

· фенолды қызылсыз Хенкс ерітіндісі (дайын, коммерциялық);

· люминол ерітіндісі (дайын);

· ФМА ерітіндісі (Rhorbol 12 myristate Dacetate), дайын;

· фикол ерітіндісі, верографин ерітіндісі.

Реактивтерді дайындау:

ХЛ стимуляторы ретінде ФМА пайдалынылса дайындау қажет:

1) №1 ФМА жатыр ерітіндісі:

· 2 г ФМА өлшенеді;

· 1 мл ДМСО ерітіндісін (диметилсульфоксид C₂H₅OS) ерітіледі. Қауіпсіздік техникасы ережелерін қатаң сақталуы тиіс;

· «Эппендорф» типті пробиркаларға 60 мкл-ден құйылады.

Тоңазытқышта t=-20ºC қолданғанға дейін сақтау керек.

2) №2 ФМА жатыр ерітіндісі:

· №1 ФМА жатыр ерітіндісінен 50 мкл пипеткамен өлшенеді;

· 10 мл Хенкс ерітіндісінде ерітіледі (фенолды қызылсыз, рН 7,2);

· «Эппендорф» типті пробиркаларға 700 мкл-ден құйылады.

Тоңазытқышта t=-20ºC қолданғанға дейін сақтау керек.

3) 0,01 моль/л люминол жатыр ерітіндісі:

· 1,77 мг люминол өлшенеді;

· 1 мл ДМСО-да ерітіледі;

· «Эппендорф» типті пробиркаларға 250 мкл-ден құйылады.

Тоңазытқышта t=-20ºC қолданғанға дейін сақтау керек.

Пайдаланудан алдын дайындау қажет: анализдердің санына қарай люминолдың жұмыс ерітіндісін. Люминолдың жатыр ерітіндісі Хенкс ерітіндісімен 100 рет араластырылады. Әрбір үлгіге 200 мкл люминолдың жұмыс ерітіндісі қажет. Мысалы, 25 үлгіге қажет: 25 үлгі х 200 мкл = 5000 мкл (жалпы көлемі), оның ішінде 4950 мкл Хенкс ерінтіндісі, 50 мкл люминолдың жұмыс ерітіндісі.

4) ФМА жұмыс ерітіндісі. Хенкс ерітіндісінің бір бөлігіне №2 ФМА жатыр ертіндісінің бір бөлігін қосу керек. Әрбір үлгіге 50 мкл ФМА жұмыс ерітіндісі қажет. Мысалы, 25 үлгіге керек: 25 үлгі х 50 мкл = 1250 мкл (жалпы көлем), оның ішінде 625 мкл Хенкс ерітіндісі және 625 мкл №2 ФМА жатыр ерітіндісі.

Хемилюминометрді жұмысқа дайындау. Зерттеуден 30 минут бұрын тоққа қосу керек. Аспаптың панеліне қажетті температураны көрсету қажет (бұл реакция үшін t=37ºC). Берілген температура көрсетілген кезде анализ жасауға кірісуге болады. Аспап қызып жатқан уақытта тәжірибені бағдарлау керек:

· хаттама жазылады, онда файлдың атауы, меню (оң, теріс бақылаулар), науқастардың тізімі, есептеу формуласы, диспенсерлердің жұмысы, ФМА мөлшері көрсетіледі;

· науқастардың үлгілерін зерттеуге дайындау. Тұтас қанның үлгілерін хемилюминометрдің пластмасса пробиркаларына (реакция пробиркаларына) енгізу қажет), оларды Хенкс ерітіндісімен 1:100 қатынаста араластыру керек (2 мкл қан және 200 мкл Хенкс ерітіндісі);

· бақылау үлгілерін дайындау:

1-ші пробирка – хемилюминесцентті бос (бланк),

2-ші пробиркаға 400 мкл Хенкс ерітіндісі енгізіледі,

3-ші пробиркаға 200 мкл Хенкс ерітіндісі және 200 мкл люминолдың жұмыс ерітіндісі енгізіледі (2-ші және 3-ші пробиркалар бейспецификалық хемилюминесценцияланудың бақылауы ретінде).

Анализ жүргізу техникасы:

· ішінде үлгілері және бақылау материалдары бар пробиркаларды аспапқа салу керек;

· алдыңғы үш ұясына бақылау пробиркалары, қалғандарына науқастардың тұтас қанының араласқан үлгілері салынады;

· аспаптың «старт» сигналы қосылады. Реакцияның бұл кезеңінде 20-40 минуттан соң спонтандық хемилюминесценция (адгезия – қан жасушалары пробикалардың қабырғаларына жабыса бастайды) байқалады;

· спонтандық хемилюминесценциялану уақыты аяқталғаннан соң автоматтық түрде әрбір пробиркаларға 50 мкл ФМА жұмыс ертіндісі (стимулятор) құйылады. Кейін кинетикалық режимде индуцирленген нейтрофилдың белсенділігі байқалады – индуцирленген хемилюминесценция;

· реакция аяқталған соң нәтижелері автоматтық түрде жазылады (бағдарламаланған көрсеткіштер: спонтандық, индуцирленген хемилюминесценция). Сонымен қатар, стимуляция индексі де анықталады – индуцирленген ХЛ оң мәнді жасушалардың пайызы спонтандық ХЛ оң мәнді жасушалардың пайызына қатынасы.

Спонтандық хемилюминесценция нейтрофилде фагоцитоздың нәтижесінде болатын «метаболизмдік жарылысты» дәлелдейді.

Стимуляция кезінде нейтрофилдердің белсенділігі жоғарылайды. Индуцирленген хемилюминесценция нейтрофилдердің бактерицидті қызметінің қорын сипаттайды. Басқалармен бірге фагоцитозды анықтау әдісі аурудың ағымын болжауға және емдеу тәсілдерінің әсерін бағалауға мүмкіндік береді.

Сапаны бақылау:

· бақылау сынамаларының нәтижелерін бағалау;

· бақылау материалдарының көрсеткіштерін Шухарт картасына енгізу керек;

· науқастардың жолдамаларын толтыру.

Сау адамдарда ХЛ көрсеткіштері төмендегідей болады:

Тәжірибелік сабақ 9

ТАҚЫРЫП: Бейспецификалық қорғаныс факторлары. Фагоциттер жүйесі. Тетразолий нитрокөгінің (ТНК) қалыптасу сынамасында нейтрофилдердің жалпы тотығу-тотықсыздану белсенділігін анықтау.

Сабақтың жоспары:

1. ТНК әдісінің принципі.

2. Реакцияның компоненттері.

3. Реактивтерді дайындау.

4. Лейкоқорытпаларды дайындау.

5. Нәтижелерді бағалау, көрсеткіштерді есептеу.

6. Сапаны бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· инкубациялық ортаны дайындай білу;

· фосфатты буфер дайындай білу;

· опсонизацияланған зимозан қорытпасын дайындай білу;

· физиологиялық ертінді дайындай білу;

· бояуларды дайындай білу;

· гепаринделген қан дайындай білу;

· ерітінділердің молярлығын есептеу білу;

· сараптама таразыларымен жұмыс істей білу;

· орта цитохромдық коэффициентті (ОЦК) және стимуляция индексін (СИ) есептей білу;

· сапаға бақылау жүргізе білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

ТНК-сынамасы фагоциттеуші нейтрофилдерді анықтап ғана қоймай, олардың ферментті жүйелерін сипаттайды, себебі ТНК қалыптастыру қарқыны бактерицидті әсері бар биототықтандырушылардың өнімін қамтамасыз ететін қуат процестерін көрсетеді.

Әдістің принципі нейтрофилдердің ТНК жұту және оны ерімейтін диформазан гранулдарына қалыптастыратын қабілетіне негізделеді. ТНК қалыптасуын фагоцитоз процесінде, сонымен қатар, белсенген нейтрофилдің жоғары метабоилзмденуінен бөлінетін қуат және «метаболизмдік жарылыс» тотығу-тотықсыздану реакциясының өнімдері қамтамасыз етеді.

Реактивтер мен жабдықтар:

· KH₂PO₄; Na₂HPO₄; NaCl; метанол, физерітінді;

· 0,1% нейтралды қызыл;

· 2% метил жасылы немесе басқа ядролық бояулар: 0,5% сафранин, гематоксилин және т.б.; Пропердинді анықтау үшін зимозан (дрожждердің қабырғалары);

· пробиркалар;

· шынылар;

· 1 мл пипеткалар;

· термостат;

· микроскоп.

Реактивтерді дайындау:

1) инкубациялық орта (фосфатты-тұзды буферде (ФТБ) 0,2% ТНК ерітіндісі). Зерттеу алдында дайындалады, 1-2 сағат сақталады. 1 мл 0,15 моль/л ФТБ + 2 мг ТНК. 0,15 моль/л ФТБ (рН 7,2):

· 20 мл 0,15 моль/л KH₂PO₄ ерітіндісі + 80 мл 0,15 моль/л Na₂HPO₄ ерітіндісі + 0,85 г NaCl,

· (0,15 моль/л KH₂PO₄ ерітіндісі = 2,04 г KH₂PO₄+ 100 мл Н₂О),

· (0,15 моль/л Na₂HPO₄ ерітіндісі = 2,13 г Na₂HPO₄+ 100 мл Н₂О);

2) опсонизацияланған зимозан қорытпасы (25% = 250 мкг/мл). 100 мг зимозан (пропердинді анықтау үшін) 1 сағат бойы, 10 мл физерітіндіні 1 тамшыдан тамызып отырып мұқият ұнтақтау керек. Қоспаны 1000 айн/мин 10 минут айналдыру керек. Тұнба үстіндегі сұйықтықты төгіп тастып, тұнбаны 20 мл физерітіндіге қосу керек. Алынған 0,5% суспензияны тоңазытқышта t=+4ºC пайдаланғанға дейін сақтауға болады.

Зимозанды опсонизациялау үшін 0,5 мл 0,5% зимозан қорытпасын + 4-5 донордың 0,25 мл сары суын (IV қан тобы) + 0,25 мл физерітіндісін t=37ºC 30 минут инкубациялау қажет. Кейін зимозан екі рет жуып, көлемін ФТБ-мен 10 мл дейін жеткізу керек.

3) 2% метил жасылы 2,5-3 г метил жасылы 100 мл 0,2 моль/л ацетат буферінде ерітіледі. Бұл үшін 100 мл дистиллирленген суда 2,7 г натрий ацетаты қажет (рН 4,9 дейін концентрацияланған сірке қышқылымен жеткізеді). Бояу ерітіндісін бөлгіші бар шұңқырға (воронка) салып, метил күлгінін экстракттау үшін осы көлемде хлороформ қосылады. Хлороформ көк-күлгін түске боялуы тоқтау үшін оны күнделікті (4-5 раз) ауытырылып тұруы тиіс. Метил жасылы ерітіндісі ұзақ уақыт қараңғы жерде сақталады.

Анализді жүргізу техникасы.

Екі пробиркаға 0,1 мл-ден гепаринделген қан немесе лейкоқорытпасы құйып, 0,1 мл-ден инкубациялық қоспа қосылады: 1-ші пробиркаға 0,1 мл ФТБ (спонтанды ТНК-сынама), 2-ші пробиркаға – 0,1 мл зимозан қорытпасы (250 мкг/мл) немесе декстран сульфаты (300 мкг/мл) (белсендірілген ТНК-сынама) енгізіледі. Пробиркалар t=37ºC 20 минут инкубацияланады, кейін центрифугада айналдырып, тұнбадан жағынды дайындалады. Жағындыдар кептіріліп, метанолмен 5 минут бекітіледі, кейін 10 минут бойы 2% метил жасылымен немесе 1% сафранинмен боялады.

Нәтижелерді есептеу.

100 нейтрофилдер саналып, құрамында гранул немесе тұтас шөгінді түріндегі диформазан бар жасушалардың пайызы есептеледі; Астальди-Верг формуласы бойынша орта цитохимиялық коэффициент (ОЦК) есептеледі. Бұл үшін жасушалар диформазан гранулдарының санына қарай төртке бөлінеді:

а) нөлдік белсенділікпен (гранулдар жоқ) – 0;

б) әлсіз оң мәнді реакция (бірлі-жарым гранулдар) – 1+;

в) оң мәнді реакция (гранулдар цитоплазма бетінің 50%-н қаптайды) – 2++;

г) аса оң мәнді реакция (цитоплазма бетінің 50%-дан жоғары ауданы гранулдармен қапталған) – 3+++.

Есептеу үшін жасушалардың зертханалық санауышты қолданған жөн:

1-ші клавишада теріс мәнді жасушалар енгізіледі; α

2-ші клавишада - әлсіз реакциялы жасушалар; b

3-ші клавишада – оң мәнді реакциялы жасушалар; с

4-ші клавишада – аса оң мәнді жасушалар; d

(a+в+c+d) = 100, оң мәнді жасушалардың пайызы (в+c+d) = 100-а%.

Орта цитохромдық коэффициент (ОЦК) = (1 х в + 2 х с + 3 х d) / 100.

Стимуляция индексі төмендегідей есептеледі:

СИ = белсенген ТНК-сынамадағы оң мәнді жасушалардың пайызы

спонданды ТНК-сынамадағы оң мәнді жасушалардың пайызы

Сапаны бақылау.

Алдыңғы сабақтардағы сапаны бақылау бөлімін қараңыздар.

Нәтижелерді бағалау.

Сау адамдарда ТНК-ны диформазанға дейін спонтанды қалыптастырушы нейтрофилдердің пайызы 10% аспайды. Қалыпты жағдайда стимуляция нәтижесінде оң мәнді нейтрофилдердің ТНК саны 40-80% дейін жоғарылайды, стимуляция индексі 5-10 құрайды.

ТНК-сынамасының көрсеткіштері спонтанды және индуцирленген фагоциттік және бактерицидтік қызметінің төмендеуінде аз болады. Бұл нейтрофилдердің бұзылуына немесе гуморалдық факторлардың жетіспеушілігіне байланысты болуы мүмкін.

Тәжірибелік сабақ 10

ТАҚЫРЫП: Иммундық жауап. Циркуляциядағы иммундық комплекстер. Анықтау әдістері. РИД.

Сабақтың жоспары:

1. Иммундық комплекстер. Анықтау әдістері. Фотометрия, нефелометрия. РИД. ИК типтеу.

2. Реактивтерді дайындау.

3. Жабдықтар мен қосымша материалдарды дайындау.

4. Айналымдағы иммундық комплекстерді (АИК) анықтау техникасы.

5. АИК типтеу техникасы.

6. Сапаны бақылау.

Тәжірибелік дағдылар.

Тапсырмаларды орындау үшін алдыңғы сабақтарда алған тәжірибелік дағдылар мен білімдер қажет:

· реактивтер мен бақылау материалдарын дайындай білу;

· бинокулярлық лупамен және сараптама таразымен жұмыс істей білу;

· иммунодиффузиялық планшеттерге үлгілерді сала білу;

· сапасын бақылауды жүргізу білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Кез келген иммундық жауап иммундық комплекстердің (ИК) түзілуіне алып келеді. Қалыпты жағдайда «Аг+Ад» комплекстері фагоцитоздалады және организмнен шығарылады. Патологиялық жағдайларда (фагоцитоздың жетіспеушілігі және т.б.) аутоантиденелерден, аутоантигендерден, комплементтің компоненттерінен және т.б. заттардан тұратын ИК ұлпаларда, қан тамырларының қабырғасында және т.б. орналасып, иммундық комплекстік ауруларды туғызады. ИК комплемент жүйесін белсендіріп, агрессиялық реакциялардың түзілуіне алып келеді. Осыған байланысты АИК және оның құрамын анықтау клиникада өте маңызды. АИК анықтаудың бірнеше әдістері бар: преципитация, турбодиметрия, термистография, ИФТ және т.б. Преципитация әдісі лабораториялық иммунологияга өте кең тараған.

Әдістің принципі.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) ерітіндісі агрегацияланған иммундық глоюбулиндерді және иммундық комплекстерді сары судан бөліп алуға қабілетті. ПЭГ әртүрлі концентрациялары (2,5%; 3,5%; 7% және 10%) молекулалық массасы және көлемі әртүрлі иммундық комплекстердің преципитациялануына алып келеді. ПЭГ төмен концентрациялары ірі көлемдегі комплекстерді тұндырады, жоғары концентрациялары төмен молекулалы қосындыларды преципитацияландырады. 3,5% ПЭГ кең тараған (аралық) орташа көлемдегі комплекстерді преципитацияландырады.

Реактивтер мен жабдықтар:

· айналымы 2000 айн/мин кем емес жылдамдатқышы бар жоғары айналымды центрифуга;

· спектрометр немесе бинокулярлы микроскоп;

· «эппендорф» типті пробиркалар;

· иммунодиффузиялық плашкілер (дайын, коммерциялық);

· бақылау сары суы;

· борат буфері;

· буферленген ерітінді;

· 3,5% ПЭГ;

· 7% ПЭГ.

Реактивтерді дайындау:

1) Борат буфері (ББ): рН 8,4:

· 3,410 г бор қышқылын және 4,275 бура өлшенеді;

· аз мөлшерде дистиллирленген суда ерітіп және дистиллирленген суды 1 литрге дейін жеткізіп, ерітіндінің рН ионометрде өлшену керек;

· бөлме температурасында пайдаланғанға дейін сақталады.

2) 7% ПЭГ ерітіндісі Мм 6000, рН 7,2:

· 35 г ПЭГ өлшенеді;

· дистиллирленген сумен 500 мл жеткізу керек (ерітінді жақсы еруі үшін 30-60 минут t=37ºC термостатқа қоюға болады).

3) Борат буфері 3,5% ПЭГ:

· 17,5 г ПЭГ өлшенеді;

· борат буфері ерітіндісімен 500 мл жеткізу керек (рН 8,4).

қараңғы ыдыста бөлме темературасында сақтау керек.

4) Буферленген физиологиялық ерітінді (БФЕ) рН 7,2-7,4:

· 8,2 г натрий хлориді өлшенеді;

· 1,15 г натрий фосфорлы қышқылы екі ауыстырылған (Na₂HPO₄) 0,2 г калий фосфорлы қышқылы екі ауыстырылған (К₂HPO₄);

· дистиллирленген сумен 1 литрге дейін жеткізу керек;

· рН өлшеу керек;

· пайдаланғанға дейін бөлме температурасында сақталады.

Анализді жүргізу техникасы.

АИК сараптамасы екі кезеңнен тұрады:

1-ші кезең – АИК бөліп алу;

2-ші кезең – АИК типтеу.

1. АИК бөліп алу:

· науқастардың сары суын пробиркаларда борат буферімен 1:25 немесе 1:50 есеппен араластыру керек; 50 мкл сары су + 1,2 мл борат буфері немесе 100 мкл сары су + 2,5 мл борат буфері;

· науқастардың сары су бар әр пробиркаға 7% ПЭГ ерітіндісін қосу керек (1:1) 1,25 мл немесе 2,5 мл;

· шыны таяқшамен араластырып, пробиркаларды тығыз жауып қою керек. Пробиркалар штативте +4º тоңазытқышта 18 сағатқа қойылады:

· инкубациялағаннан кейін 30 минут 3000 айн/мин айналдыру керек;

· айналдырғаннан кейін тұнба пайда болған жағдайда (АИК) тұнба үстіндегі сұйықтықты төгіп тасталады, ал байқалған АИК-ті 4+жүйемен есептеу қажет.

2) АИК типтеу.

· тұнбаға 1,5 мл 3,5% ПЭГ қосып, араластырылады және «эппендорф» типті пробиркаларға құйылады, кейін 2 рет 20 минут 8000 айн/мин айналдырылады;

· бір рет айналдырып болғасын тұнба үстіндегі сұйықтықты төгіп, 1 мл 3,5% ПЭГ қосу керек;

· екінші рет жуғаннан кейін тұнба үстіндегі сұйықтықты төгіп тастап, «эппендорф» типті пробиркалардан сұйықтықты фильтрлі қағазға мұқият сілку керек. 0,1 мл-ден БФЕ қосып, араластырылады. Үлгілер иммунодиффузяилық планшеттерге салу үшін дайын;

· иммунодиффузиялық планшеттерді дайындау қажет (IgA, IgM, IgG);

· иммунодиффузиялық планшеттерге 5-10 мкл-ден бақылау үлгілерін енгізу керек;

· планшеттік ойықтарына 5-10 мкл-ден зерттелетін сары суларды енгізу керек;

· бөлме температурасында 24 сағат бойы инкубирлеу қажет;

· үш планшетте (IgA, IgM, IgG) бинокулярлық лупаның көмегімен бақылау үлгілеріндегі және зерттелетін сынамалардағы преципитация сақиналарын санау керек.

Нәтижелерді есептеу:

· преципитаттың диаметріне қарай (АИК концентрациясы) калибрлік қисық сызу керек. Калибрлік қисық әрбір үш планшетке (IgA, IgM, IgG) сызылады;

· калибрлік қисық бойынша науқастардың зерттелетін үлгілеріндегі АИК компоненттері концентрацияларының көрсеткіштерін есептеу керек.

Сапаны бақылау.

Алдын ала сызылған Шухарт картасына бақылаулардың көрсеткіштерін қойып сапаны бақылау керек. Алынған нәтижелерді бағалау қажет.

Сау адамдарда РИД-да АИК – теріс.

Тәжірибелік сабақ 11

ТАҚЫРЫП: Лимфоциттер жүйесі. Иммунитеттің Т- және В-тізбегі. Т-лимфоциттердің санын анықтау (Е-РОК). В-лимфоциттердің санын анықтау (ЕАС-РОК).

Сабақтың жоспары:

1. Т- және В-лимфоциттер маркерлерінің сипаттамасы.

2. Әдістің принципі. Реакцияның компоненттері.

3. Реактивтерді дайындау.

4. Биоматериалдарды сараптамаға (лимфоциттерді бөліп алу) дайындау.

5. Анализді жүргізу техникасы, нәтижелерді есептеу, сапаны бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· жалпы зертханалық әдістер бойынша Горяев камерасында қан жағындысындағы лейкоциттердің санын есептей білу;

· тығыздық градиентінде лимфоциттерді бөліп ала білу;

· бөлінген популяциядағы лимфоциттердің абсолюттік және салыстырмалы санын есептей білу;

· Романовский-Гимзе әдісі бойынша бояу ерітіндісін дайындай және жағындыларды бояй білу;

· сараптамаға реактивтерді дайындай білу;

· центрифугамен, микроскоппен, Горяев камерасымен жұмыс істей білу.

Реактивтер мен жабдықтар:

· тығыздық градиентіндегі фиколл-верографин ерітіндісі (лимфоциттерді бөліп алу үшін);

· Хенкс ерітіндісі немесе 199 орта (дайын);

· глютаральдегид ерітіндісі (жасушаларды бекіту үшін);

· метанол;

· Романовский-Гимзе бояулары (жағындыларды бояу үшін);

· қой эритроциттері;

· В-лимфоциттердің санын анықтау үшін арналған ЕАС қоспасы (қой эритроциттер, комплемент ортасына жүктелген Ад);

· центрифуга;

· микроскоп, Горяев камерасы;

· ареометр немесе денситометр (ерітіндінің тығыздығын өлшеу үшін);

· силикон және пластмасса пробиркалар;

· шынылар (майсыздандырылған).

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

В – және Т-лимфоциттердің бетінде рецепторлар болады. В-лимфоциттерге тән негізгі маркерлер иммуноглобулинді рецепторлар болып табылады. Оларды анықтау үшін мембраналы иммуноглобулиндермен жасалатын иммунофлюоресценция әдісі қолданылады. Лимфоциттерге флюорохроммен белгіленген адамның иммуноглобулиндеріне қарсы қарсысары суды қоса отырып, иммуноглобулинді детерминанттары бар лимфоциттердің, яғни В-лимфоциттердің санын есептеуге болады. Сонымен қатар, В-лимфоциттерді де Т-лимфоциттерді сияқты мембранасында қой эритроциттеріне рецепторлардың болуына қарай анықтауға болады (Е-РОК, ЕАС-РОК, розетка тәрізді жасушалар).

Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 770 | Нарушение авторских прав