АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

СОЦИАЛЬНАЯ ГЕРОНТОЛОГИЯ 9 страница

ТАҚЫРЫП: Иммундық патология. Аутоиммундық жағдайлар. Енжар гемагглютинация реакциясы. Латекс-тест. Ревматоидты факторды анықтау.

Сабақтың жоспары:

1. Енжар гемагглютинация әдісінің принципі.

2. Реактивтерді дайындау.

3. Анализді жүргізу техникасы.

4. Нәтижелерді есептеу.

5. Сапаны бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· латекс реагенті мен науқастың сары суын слайд-шыныға сала білу;

· сары сулардың қажетті араласпаларын дайындай білу;

· агглютинация реакциясын есептей білу;

· сапаны бақылауды жүргізе білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Латекс-тестті зерттеу латекс бөлшектерді агглютинациялау әдісімен араласпаған сары суда бірқатар иммунологиялық көрсеткіштерді (ревматоидтық фактор) жартылай сандық анықтауға мүмкіндік береді. Әдіс орындауға өте қолайлы, экономиялық жағынан пайдалы, сараптау уақыты – 2-3 минут. Жинақта оң және теріс мәнді бақалаулар болады. Ревматоидты факторды (РФ) анықтау иммундық жүйенің бұзылуымен ерекшеленетін ревматоидтық артритті диагностикалауда маңызы бар. Бұл жағдайда иммундық комплекстер түзіліп, иммундық жауап толық болмайды. Иммундық комплекстерің түзілуінде IgG қарсы бағытталған IgA антиденелерінің көбеюімен жүретін РФ ролі негізгі болып табылады.

Әдістің принципі.

Полистирол латексті бөлшектерде орналасқан IgG мен бақылау сары суы немесе науқастың үлгісіндегі РФ арасында агглютинациялану реакциясына негізделеді. IgG + IgG-ге Aд - агглютинация.

Реактивтер мен жабдықтар:

· РФ анықтауға арналған дайын коммерциялық жинақтың құрамында болады: адамның IgG-нен тұратын полистирол латексті бөлшектер ерітіндісі;

· оң мәнді бақылау ерітіндісі, құрамында адамның IgG-не антиденелер бар;

· теріс мәнді бақылау ерітіндісі, антиденелері жоқ;

· агглютинация реакциясы жүргізілетін слайд-шыны.

Анализді жүргізу техникасы: реакцияны жүргізу алдында науқастың сары суы мен жинақты 30 минут бөлме температурасында ұстау қажет.

Слайд-шыныға бөлек ойықтарға төмендегі көрсетілгендерді пипеткалау қажет:

· науқастардың сары суын – 40 мкл;

· оң мәнді бақылау – 40 мкл;

· теріс мәнді бақылау – 40 мкл;

· әр ойыққа 40 мкл–ден латекс реагентін қосу керек;

· шыны таяқшамен жаймен араластырылады;

· нәтижелерін 2-3 минуттан соң есептеу керек.

Нәтижелерді есептеу:

· науқастардың үлгілерінің сараптамасын оң және теріс мәнді бақылаулардың нәтижелерін алған соң жүргізу қажет;

· сары суды агглютинациялану болмаса РФ жоқ;

· реакция оң мәнді (айқын агглютинациялану) болған жағдайда сары суларды буфер ерітіндісімен әртүрлі ара қатынастарда (1:2, 1:4, 1:8, 1:32) титрлеу қажет;

· үлгідегі РФ құрамы 20 МЕ/мл-ден кем болса, нәтиже теріс болады;

· оң мәнді (айқын агглютинациялану) науқастың сары суында РФ болуын білдіреді.

Ескерту: 1+1 – 40 мкл сары су + 40 мкл буфер ерітіндісі.

Сапасын бақылау:

· теріс мәнді бақылау – ойықтарда агглютинация жоқ;

· оң мәнді бақылау – слайд-шыныдағы ойықта айқын агглютинация бар;

Әдісті стандарттау:

· латекс-реакцияны жүргізу үшін слайд-шыныны қолдану;

· реагенттерді араластыру үшін таза шыны таяқшаларды қолдану;

· дозатор пипеткаларды қолдану;

· реакцияны жүргізу уақытынан ауытқымау;

· агглютинациялану нәтижелерін есептеу үшін дұрыс жарықты қолдану;

· реагенттерді дұрыс араластыру;

· реакцияны жүргізу кезінде міндетті түрде оң және теріс бақылауларды қолдану;

· реагенттерді талаптарға сәйкес сақтау.

Әдістің артықшылығы:

· скрининг-тест;

· кең қолдану мүмкіншілігі.

Әдістің кемшілігі: нәтижелерді визуалды бағалау.

Тәжірибелі сабақ 19

ТАҚЫРЫП: Иммундық патология. Иммундық пролиферативті жауап. Лейкоциттердің миграциялануын тежеу реакциясында баяу дамитын жоғары сезімталдықты бағалау.

Сабақтың жоспары:

1. Баяу дамитын жоғары сезімталдықтың (БДЖС) негізгі механизмдері.

2. Лейкоциттердің миграциялануын тежеу реакциясының (ЛМТР) принципі.

3. Реактивтерді дайындау.

4. ЛМТР жүргізу техникасы.

5. Сапаны бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· реактивтерді дайындай білу;

· реактивтерді араластыра білу;

· қан сынамасынан лейкоқорытпа ала білу;

· ЛМТР жүргізілетін аспаппен және инкубатормен дұрыс қолдана білу;

· микроскоппен дұрыс қолдана білу;

· лейкоциттердің миграциялану диаметрін дұрыс өлшей және миграциялану индексін (МИ) есептей білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Лимфоциттердің антиген спецификалық белсенуін – БДЖС әсерін зерттеу фагоциттердің спонтанды әрекетін, айналымын, қабыну аймағында фагоциттердің топталуын және бұл жасушалардың in vivo қорғаныс қасиеттерін мобилизациялауын бақылауға мүмкін туғызады. Шеткі қандағы ЛМТР әртүрлі ауруларда спецификалық жасушалық иммунитетті бағалауда ролі маңызды.

Әдістің принципі.

Спецификалық антиген болған жағдайда алдын ала сенсибилизацияланған лимфоциттер лейкоциттердің миграциялануын тежейтін фактор (лимфокин) бөледі.

Реактивтер мен жабдықтар:

· фитогемагглютинин (ФГА) – (Т-жасушалық митоген), дайын;

· L-глутамин (дайын);

· антибиотиктер: пенициллин, стрептомицин;

· 199 орта немесе Игл ортасы;

· буфер HEPES (дайын);

· стерилдеуші саптар (Millipor).

Реактивтерді дайындау:

АНТИБИОТИКТЕР:

· 3 х 1 млн пенициллинді 15 мл дистиллирленген суда еріту керек;

· 5 г стрептомицинді 15 мл дистиллирленген суда еріту керек;

· антибиотиктердің ерітінділерін аралстырып, қолданғанға дейін тоңазытқышта сақтау керек. Зерттеу кезінде оларды дақылға (культураға) ортасына қосы керек (0,35 мл антибиотиктер ерітіндісі + 500 мл дақылды орта).

HEPES буфері (1 моль/л): 2,38 г-н 10 мл 199 ортада ерітіп, стерилдеуші саптан (тесіктердің диаметрі – 0,2) стерилді флаконға өткізу керек. Қолданғанға дейін мұздатқышта сақтау керек.

L-глутамин: 3 г-н 10 мл 199 ортада ерітіп, стерилдеуші саптан стерилді флаконға өткізу керек. Қолданғанға дейін мұздатқышта сақтау керек.

Дақылды орта (стерилді): 100 мл 199 ортаға немесе Игл ортасына 1 мл L-глутамин, 0,5 мл HEPES буфері, 0,07 мл антибиотиктер ерітіндісі қосылады. Қолданғанға дейін мұздатқышта сақтау керек.

ФГА жатыр ерітіндісі: 5 мгр ФГА бар флаконға стерилді түрде 5 мл дақылды орта (1 мг/мл) қосылады. Қолданғанға дейін тоңазытқышта сақтау керек.

Бес пробиркаларда ФГА жатыр ерітіндісінің араласпаларын дайындау керек:

1-ші – дақылды орта (бақылау);

2-ші – 20 мкг/мл ФГА ерітіндісі;

3-ші – 10 мкг/мл ФГА ерітіндісі;

4-ші – 5 мкг/мл ФГА ерітіндісі;

5-ші – 1 мкг/мл ФГА ерітіндісі.

2 схема

ФГА жатыр ерітіндісін араластыру схемасы

Дақылды орталарды пробиркаларға құю керек:

№2 пробиркаға – 5 мл; №3 пробиркаға – 3 мл;

№4 пробиркаға – 2 мл; №5 пробиркаға – 4 мл;

кейін, №2 пробиркаға 0,1 мл ФГА жатыр ерітіндісін қосу керек, араластырып, ары қарай пробиркалардан ауыстыру қажет:

№ 2 пробиркадан №3 пробиркаға – 3 мл ерітінді;

№3 пробиркадан №4 пробиркаға – 2 мл;

№4 пробиркадан №5 пробиркаға – 1 мл.

Реакцияларда лейкоциттік суспензияны (Бейом бойынша) және капилляр қанын пайдалануға болады.

Анализді жүргізу техникасы:

· жайпақ түпті планшеттің ойықтарына 200 мкл-ден дақылды орта (бақылау) және 200 мкл-ден митоген ерітіндісін (ФГА) енгізу керек;

· гепарині бар пробиркаға (20 ЕД гепарин/мл қанға) саусақтан немесе венадан қан алу керек;

· 30-40 минуттан соң центрфуганың таза пробиркасына лейкоқорытпаны жинау керек, көлемін ФТБ-мен 10 мл-ге жеткізіп, 7-10 минут 1000 айн/мин айналдыру керек;

· супернатантты алып тастап, тұнбаны бастапқыдан 2-3 есе кем етіп ресуспензиялау керек;

· ЛМТР аспабы жайпақ түпті планшетке орналастырылады. Таза ұштықтар мен 5 мкл пипеткаларды алу керек. Ұштықтарды тез лейкоқорытпамен толтырып, дақылды орта және әртүрлі концентрацияда аутоантигендері бар планшеттің ойықтарына салу керек;

· планшетті горзонталді үстелдің үстіне қойып, 1 сағат инкубациялау қажет;

· инкубациядан соң аспапты алып, планшетті қақпақпен жабу және инкубаторға (СО₂ атмосферасы t=37ºC) түн бойы қою керек.

Реакцияны келесі күні микроскоппен тіркеледі. Тәжірибе үлгілеріндегі және бақылаудағы миграциялану диаметрін өлшеу керек.

Аутоантигендердің қолданылған концентрациялары үшін МИ есептеу керек:

МИ = Д² тәжірибе

Д ² бақылау

<0,85 және >1,15 МИ Т-лимфоциттердің сенсибилизациялануын білдіреді. Лимфоциттердің миграциялану индексі бойынша тек қана науқастардың лимфоциттері әсерлесетін аутоантигендердің мөлшерін таңдауға болады. ЛМТР есептеу аутоиммундық ауруларға скринингтік зерттеулер жүргізуге мүмкіндік береді.

ЛМТР анықтау үшін басқа да әдіс қолдануға болады.

ЛМТР капиллярлық әдіспен анықтау. Клиникалық иммунологияда ЛМТР анықтаудың капиллярлық әдіс кең тараған.

Тәжірибені жүргізу.

Белгілі бір диаметрдегі капиллярлар жасушлар суспензияларын енгізу арқылы лейкоциттермен толтырылады. Антигендер (бактериялар, вирустар, саңырауқұлақтар және т.б.) жасушалар суспензиясына немесе инкубациялық камералардың орталарына қосылады. Капиллярлар 199 ортасы бар камераларға салынып, t=37ºC 18-24 сағат бойы инкубацияланады. Бұл уақыт ішінде лейкоциттер капиллярлардан миграцияланып, бұлдырланған аймағын түзеді. Антигенге сенсибилизациялану болған жағдайда лимфоциттер лейкоциттердің миграциялануын тежейтін факторды синтездейді. Осы аймақтың ауданы өлшенеді. Реакция тәжірибедегі және бақылаудағы (антиген жоқ) миграциялану ауданының мөлшері бойынша есептеледі. Реакция агароза ортасында жасалуы мүмкін. МИ (%) мына формула бойынша есептеледі: антигенмен лимфоциттің миграциялану орташа ауданы / антигенсіз лимфоциттің миграциялану орташа ауданы + 100, пайызбен есептеледі. МИ 80%-дан кем болса – оң мәнді. Сенсибилизациялану қанша жоғары болса, миграцияланудың тежелуі сонша көп болады, осыған сәйкес МИ пайызы төмен болады. Миграцияланудың тежелуі 20%-дан жоғары болса оң мәнді болғаны.

Әдісте тері сынамаларысыз лимфоциттердің әртүрлі аллергендер мен антигендерге сенсибилизациялануын анықтауға болады.

Тәжірибелік сабақ 20

ТАҚЫРЫП: Иммундық патология. Иммунтапшылық жағдайлар. Лимфоциттердің бласттрансформациялану реакциясында лимфоциттердің функционалдық жағдайын анықтау.

Сабақтың жоспары:

1. Иммунтапшылық жағдайлар.

2. Бағалау әдістері

3. Лимфоциттердің бласттрансформациялану реакциясының (ЛБТР) принципі.

4. Реактивтерді дайындау.

5. Анализді жүргізу, нәтижелерді есептеу, сапаны бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· реактивтерді дайындай білу;

· биоматериалдарды (науқастың гемолизденген қаны) дайындай білу;

· жағындыларды дайындау және Романовский-Гимзе бойынша бояй білу;

· центрфугамен және микроскоппен жұмыс істей білу;

· бласттарды санай білу.

Реактивтер мен жабдықтар:

· 199 немесе Игл ортасы (дайын);

· ірі қара малдың белсенсіздірілген сары суы;

· патоген лимфоциттері (дайын);

· 10%-ды сірке қышқылы;

· стерилді пипеткалар, пенициллин ыдысы, пластик ұштықтар, стерилдеуші саптар (қайнатуға болады);

· автоматты пипеткалар;

· термостат;

· микроскоп.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Жасушалардың бейспецификалық белсендіргіштерге (митогендерге) және спецификалық антигендерге (қарапайымдылар, саңырауқұлақтар, бактериялар, вирустар, дене ұлпалары) физиологиялық белсенділігін анықтау үшін арналған ЛБТР иммунтапшылық жағдайларды (ИТЖ), аутоиммундық және аллергиялық ауруларды бағалауда, трансплантациялық иммунологияда – донор мен реципиентті таңдауда аса маңызды болып табылады.

Әртүрлі митогендер мен реакцияны жүргізу үшін қолайлы жағдайларды таңдай отырып, жалпы популяциядағы Т- және В-лимфоциттердің санын анықтауға болады.

Реакцияның принципі – белсендіргіштердің (митогендер немесе антигендер) әсерінен лимфоциттердің белсенуі (пролиферациялану, трансформациялану) олардың бласттарға (үлкен бөлінетін жасушалар) айналуына алып келеді.

Белсендіргіштер ретінде ФГА, конкавалин (Кон-А), лаконос митогені (ЛМ), бактериялық полисахаридтер (ЛПС), ферменттер, аллергендер және т.б. қолданылады. ЛБТР жүргізу қолайлы болу үшін белсендіргіштердің бірнеше мөлшерін (оптималді, төмен және жоғары) қолданған және әртүрлі уақыт культивациялаған жөн.

Анализді жүргізу техникасы:

Стерилді пенициллин пузырьки бақылау (1) және тәжірибе (2) үшін реактивтер енгізіледі.

Пенициллин ыдыстарды резина қақпақтармен жауап, 4 тәулік t=37ºC термостатта өңдеу керек.

Нәтижелерді есептеу:

· Ыдыстардың ішіндегілерді пробиркаларға жинап, 10 минут 1000 айн/мин айналдыру керек.

· Супернатантты алып тастау керек. Тұнбаны 10 мл 10% сірке қышқылында ресуспензиялап, қайта айналдыру керек (10 минут 1000 айн/мин).

· Супернатантты алып тастау керек. Тұнбаны ресуспензиялап, ментанол тамшысын қосу керек.

· Жағындылар дайындалып, ауада кептіріледі. Романовский-Гимзе бойынша бояу керек.

· 100-200 лимфоциттер арасындағы бласттардың пайызын есептеу керек.

Бласттарды автоматтық сцинтилляциялық санауышты қолдана отырып, митоздық циклға қатысқан жасушаларға радиобелсенді изотоптың енуіне байланысты жасуша дақылындағы радиобелсенділіктің өзгеруіне қарай есептеуге болады.

Бақылауда бласттар болмайды, митоген бар тәжірибе үлгілерінде бласттар 60-80% құрайды.

Анализді жүргізудің басқа да тәсілі бар.

Б а қ ы л а у (1) Т ә ж і р и б е (2)

- 5 мл дақылды орта, - 5 мл дақылды орта,

+ 0,1 мл науқастың гепаринделген қаны. + 0,1 мл науқастың гепаринделген

қаны,

+ 50 мкг ФГА.

3-4 тәулік t=37ºC термостатта өңдеу керек. ЛМТР үшін дайындалған дақылды ортаны қолдануға болады (19 сабақты қараңыз).

Сапасын бақылау.

Алдыңғы сабақтарды жасалған бойынша.

Бастапқы білімді бақылау үшін тест-сұрақтары

1. Иммунология – бұл:

a. адам ағзанысының қорғаныс қызметтері туралы ғылым

b. адам денесінің құрылысы туралы ғылым

c. мүшелер, ұлпалар қызметтері туралы ғылым

d. ағзадағы биохимиялық реакциялар туралы ғылым

e. қан жүйесін зерттеу туралы ғылым

2. Иммундық жүйенің орталық мүшелеріне жатады:

a. көк бауыр

b. тимус

c. бауыр

d. жүрек

e. лимфа түйіндері

3. Иммундық жүйенің шеткі мүшелеріне жатады:

a. бүйрек

b. тимус

c. жүрек

d. сүйек кемігі

e. лимфа түйіндері

4. Қайсы мүшелерде Т және В-аймақтар бар:

a. бүйрек

b. тимус

c. лимфа түйіндері

d. жүрек

e. сүйек кемігі

5. Организмнің арнайы емес қорғаныс факторларына жатпайды:

a. фагоцитоз

b. тері және шырышты қабықтар

c. қалыпты микрофлора

d. иммуноглобуллиндер

e. интерферондар

6. В-лимфоциттердің негізгі қызметі:

a. иммуноглобуллиндерді синтездеу

b. реттеуші

c. эффекторлық

d. фагоцитоз

e. киллерлік

7. Фагоциттердің қызметіне жатпайды:

a. секреторлық

b. қорғаныс

c. тосқауыл жасау

d. таныстыру

e. миграциялану

8. Микрофагтарға қайсы жасушалар жатады:

a. эритроциттер

b. гранулоциттер

c. В-лимфоциттер

d. дің жасушалар

e. лимфоциттер

9. Макрофагтардың қызметі:

a. иммуноглобулиндерді өндіру

b. басқа иммундыкомпетентті жасушалармен әсерлеседі

c. фагоцитоз, пиноцитоз, секреторлық және синтездік қызмет

d. комплемент жүйесін белсендіреді

e. антиденелерді өндіру

10. Моноциттер мына жасушаларға жатады:

a. лимфоциттерге

b. макрофагтарға

c. киллерлерге

d. эффекторларға

e. супрессорларға

11. Т-лимфоциттердің негізгі қызметі:

a. иммуноглобуллиндер синтезі

b. таныстыру

c. эффекторлық

d. иммунологиялық есте сақтау жасушаларының синтезі

e. фагоцитоз

12. Иммундық жүйенің гуморалдық тізбегін зертханалық бағалау әдісі:

a. иммунофлюоресценция

b. микроскопия және ағын цитометрия

c. жарық миркоскопында иммунофенотиптеу,

d. электрофорезді айыру.

e. агглютинациялау реакциясы

13. Агглютинациялау реакциясы қолданылады:

a. сары суда, плазмада және басқа биологиялық сұйықтықтарда антигендер мен антиденелерді жарты сандық анықтау үшін

b. ерігіш антигендерді анықтау үшін

c. көп компонентті антигендерді және антиденелерді анықтау үшін

d. антигендерді немесе антиденелерді анықтауға арналған тікелей емес

e. лимфоциттермен өндірілетін спецификалық антиденелерді анықтау үшін

14. Преципитациялау реакциясы қолданылады:

a. сары суда, плазмада және басқа биологиялық сұйықтықтарда антигендер мен антиденелерді жарты сандық анықтау үшін

b. ерігіш антигендерді анықтау үшін

c. көп компонентті антигендерді және антиденелерді анықтау үшін

d. антигендерді немесе антиденелерді анықтауға арналған тікелей емес

e. лимфоциттермен өндірілетін спецификалық антиденелерді анықтау үшін

15. Иммуноэлектрофорез әдісі қолданылады:

a. сары суда, плазмада және басқа биологиялық сұйықтықтарда антигендер мен антиденелерді жарты сандық анықтау үшін

b. ерігіш антигендерді анықтау үшін

c. көп компонентті антигендерді және антиденелерді анықтау үшін

d. антигендерді немесе антиденелерді анықтауға арналған тікелей емес

e. лимфоциттермен өндірілетін спецификалық антиденелерді анықтау үшін

16. Т-лимфоциттердің популяциялары мен субпопуляцияларын анықтау үшін қолданылады:

a. иммунофлюоресценция

b. микроскопия және ағын цитометрия

c. жарық миркоскопында иммунофенотиптеу,

d. электрофорезді айыру.

e. агглютинациялау реакциясы

17. Ағын цитофлюориметрия: