АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

СОЦИАЛЬНАЯ ГЕРОНТОЛОГИЯ 7 страница

Әдістің принципі

В- және Т-лимфоциттерді қой эритроциттерімен «розетка» түзу қабілетіне қарай анықтауға негізделеді. «Розеткалар» үш немесе одан да көп қой эритроциитерімен қоршалған лимфоциттер. В- және Т-лимфоциттер құрамының пайызы 200 лимфоциттерге «розеткалар» санын есептеу арқылы анықталады.

В- және Т-лимфоциттердің санын анықтау иммунтапшылық жағдайларды диагностикалауда, гуморалдық және жасушалалық иммунитетті бағалауда, лимфопролиферативті, жұқпалы және басқа ауруларды анықтауда және оларды емдеуді бақылауда аса маңызды.

Сау адамдарда В-лимфоциттер жалпы лимфоциттер санының 20-30%-н, Т-лимфоциттер 50-70%-н құрайды, лимфоциттердің шамамен 10%-ында В- және Т-лимфоциттерге рецепторлар жоқ.

Реактивтерді дайындау:

1) фиколл-верографин ерітіндісі (лимфоциттерді бөліп алу үшін):

· 76% верографин ерітіндісінен 33,8% верографин дайындау (тығыздығы – 1,200): 33,9 мл 76% верографин + 42,1 мл ди- немесе тридистиллирленген су = 76 мл 33,8% верографин;

· фиколлдан 9% ерітінді дайындау (тығыздығы – 1,025): 10,8 г фиколл + 109,2 мл су = 120 мл 9% фиколл;

· верографиннің 7 бөлігін фиколлдың 16 бөлігімен қосу керек: 52,5 мл верографин + 120 мл фиколл = 172,5 фиколл-верографин ерітіндісі (тығыздығы – 1,077). Тығыздық ареометрмен өлшенеді. Жақсы еріту үшін t=37ºC жылытылған су қолданған жөн. Верографинге фиколл ерітіндісі қосылу тиіс, керісінше емес.

2) қой эритроциттері:

· бір жануардың эритроциттері немесе бірнеше жануарлардан алынған қоспа қолданылады. Эритроциттерді 2 апта бойы +4ºС Олсвер ерітіндісінде сақтауға болады. Пайдаланудан алдын қой эритроциттерін 3-4 рет фосфат буферімен жуып, көлемі бойынша 0,5% жасушалар қоспасын дайындау керек.

3) Олсвер ерітіндісі:

· 2,05 г глюкоза + 0,8 г натрий цитраты + 0,42 г натрий хлориді + 100 мл дистиллирленген су (рН 6,1 дейін лимон қышқылы ерітіндісімен жеткізу керек).

В- және Т-лимфоциттерді анықтау үшін шеткі қаннан лимфоциттерді бөліп алу:

· ЭДТА бар пробиркаға (10 мл қанға 1 мл 2,7% Na₂ ЭДТА ерітіндісі) венадан алынған қанды Хенкс ерітіндісімен (Ca⁺⁺ және Mg⁺⁺ жоқ) 1:3 есеппен араластыру керек;

· пробиркаға 3 мл фиколл-верографин ерітіндісі (тығыздығы 1,077 г/см³) құйылады;

· пастер пипеткасының немесе инесі ұзын шприцтің көмегімен фиколл-верографин ерітіндісінің үстіне жаймен пробирканың қабырғасын бойлап 8 мл араласқан қанды қабаттау керек;

· пробиркаларды 30 минут тік күйінде 400 g/мин айналдыру қажет;

· айналдырғаннан соң фиколл-верографин мен қан қоспасының шекарасында пайда болған ақшыл сақинадан жаймен пастер пипеткасымен мононуклеарлық жасушалардың қоспасын жинау керек. Биоматериал сараптамаға дайын.

Анализді жүргізу техникасы.

1. Т-жасушалардың санын анықтау үшін:

· қой эритроциттерінің концентрациясын Хенкс ерітіндісімен (немесе 199 ортамен) 0,5%-ды концентрацияға дейін жеткізу керек;

· көлемі 1,2 мл силикон немесе пластмасса пробиркаларға 0,1 мл лимфоциттер градиентінен бөліп алынған суспензияларды енгізіп, көлемін Хенкс ерітіндісімен немесе 199 ортамен 2 х 10⁶ мл жеткізу қажет;

· қоспа 37ºС 5 минут инкубирленеді, кейін 5 минут 750 айн/мин айналдырып, 60 минут t=12ºC инкубирленеді;

· инкубациядан соң жасушаларды глютаральдегидпен (0,1 мл 0,8% ерітінді) бекіту керек. Жағындылар метанолда (немесе Никифоров қоспасында) бекітіледі. Романовский-Гимзе бойынша боялады.

2. В-жасушалардың санын анықтау үшін:

· фиколл-верографин градиентінде бөліп алынған лимфоциттерді Хенкс ерітіндісімен немесе 199 ортамен 2 х 10⁶ мл жеткізу қажет;

· силикон немесе пластмасса пробиркаларға 0,1 мл лимфоциттерді және 0,1 мл 0,5% ЕАС комплекс ерітіндісін (қой эритроциттер, комплемент ортасында жүктелген Ад) енгізу керек;

· қоспа 150-200g/мин 5 минут айналдырылады. Пайда болған «розеткалар» пробиркаларға 0,05 мл 3% фосфат буферіндегі глютаральдегид ерітіндісін қосу арқылы бекітіледі. Бекіту уақыты 20 минут бөлме температурасында және артық дистиллирленген суды қосу арқылы бекітуді тоқтатады;

· кейін жасушалар айналдыру (150-200g/мин) арқылы тұнбаға түсіріледі. Тұнба үсітндегі сұйықтық алынады. Қалған қоспа пипеткаланып, жақсы майсыздандырылған шыныға салынады, соң шыны ауада кептіліріп, метанолда 5 минут бекітіледі. Романовский-Гимзе бойынша боялған соң препараттар жасушаларды санауға дайын. Боялу уақыты – 17-20 минут 1:10 есеппен.

Нәтижелерді есептеу.

Алынған Т-және В-жасушалардың жағындылары иммерсиялық микроскопта қаралады. 200 лимфоцит ішінде бетіне үш немесе одан көп эритроциттерді қондыратын лимфоциттердің саны есептеледі.

Олардың саны төмендегі формула арқылы абсолютті санға айналдырылады:

Е-РОК абс. саны = лейкоциттердің абс.саны х лимфоциттердің % + % Е-РОК

10 000

Сапаны бақылау.

Алдыңғы сабақтарда берілген жалпы принцип бойынша жасалады.

Тәжірибелік сабақ 12

ТАҚЫРЫП: Лимфоциттерің Т-жүйесі. Анықтау әдістері. Лимфоцит токсикалық сынамасы.

Сабақтың жоспары:

1. Қанның клиникалық сараптамасы. Көрсеткіштердің сипаттамасы.

2. Әдістің принципі және цитотоксикалық реакциясының түрлері. Қарсы-Т-сары суымен жасалатын цитотоксикалық сынама (ЦТС).

3. Реакция компоненттерінің сипаттамасы. ЦТС жүргізуге дайындау.

4. Биоматериалдарды зерттеуге дайындау.

5. Антикоагулянттар. Сипаттамасы.

6. Сапасын бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· ЦТС-да қанды зерттеу үшін қажет антикоагулянтты қолдана білу;

· жалпы зертханалық әдіс бойынша Горяев камерасында қанның жағындысындағы лейкоциттерді санай білу;

· Романовский-Гимзе әдісі бойынша бояудың жұмыс ерітіндісін дайындай білу;

· тығыздық градиентінде лимфоциттерді бөліп ала білу;

· бөліп алынған популяциядағы лимфоциттердің абсолюттік және салыстырмалы құрамын анықтай білу;

· лимфоциттердің тіршілік қабілетін бағалай білу;

· комплементтің араласпасын дайындай білу;

· қарсы-Т-сары суымен жасалатын ЦТС жүргізе білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Зерттеуді жүргізу үшін қанның клиникалық сараптамаларының қалыпты көрсеткіштерін, жалпы зертханалық әдіс бойынша лейкоциттер мен лимфоциттердің санын есептеуді білу шарт.

Лимфоцитотоксикалық сынама – Т-лимфоциттердің барлық мембраналық антигендерінің сомасын анықтайтын иммунологиялық реакция. Жасушалық иммунитетті зерттеу әдістерінің арасында жасушалық жоғары сезімталдықты зерттеуге мақсатында клиникада қолданылатын лимфотоксикалық сынамаға қызығушылық өте жоғары.

Әдістің принципі.

Т-лимфоциттердің мембраналық антигендеріне қарсы Т-антиденелермембраналық антигендермен байланысып, комплементтің қатысуымен түзілген комплекс жасушаның мембранасының тұтастығын бұзады – мембранаға шабуыл жасаушы комплекс (МШК). МкАд және комплементтің қатысуымен лимфоциттер цитолизденеді. Трипан көгі бояуы жасушаның ішіне еніп, оны көк түске бояйды. Бетінде Т-антигендері жоқ жасушалардың мембраналары зақымданбайды (тіршілікке бейімді) және боялмайды. Жасушалармен жүргізілетін барлық жұмыс стерилді ыдыста жасалды.

Реактивтер мен жабдықтар: буферленген физиологиялық ерітінді;

· тығыздық градиентінің ерітіндісі немесе дайын ерітінді (гистопак және т.б.);

· Хенкс ерітіндісі (дайын);

· 199 орта (дайын);

· трипан көгі ерітіндісі (бояу);

· қарсы-Т-сары су (дайын);

· цитратты гемостабилизатор;

· бинокулярлық лупалы микроскоп;

· Горяев камерасы;

· шынылар.

Жасушалық иммунитетті зерттеу үшін реактивтерді дайындау:

1) Буферленген физиологиялық ерітінді (БФЕ) 0,15 моль/л, рН 7,2-7,4:

· 8,2 г натрий хлоридін өлшеп алу керек;

· 1,15 г екі ауыстырылған натрий фосфорлы қышқылы (Na₂HPO₄);

· 0,2 г екі ауыстырылған калий фосфорлы қышқылы (К₂HPO₄);

· дистиллирленген сумен 1 литрге дейін жеткізу керек;

· ионометрде рН өлшей керек;

· бөлме температурасында сақталады.

2) 1,077-1,078 г/мл тығыздық градиентіндегі ерітінді: дайын түрін (гистопак және т.б.) қолдану немесе дайындау қажет:

А ерітіндісі – 9% фиколл ерітіндісі Мм 400:

· 9 г фиколл өлшенеді;

· 1 л БФЕ-де ерітіледі.

Б ерітіндісі – 34% верографин ерітіндісі:

· бастапқы 76% верографинді стерилді дистиллирленген сумен 2,2 есе аралстыру қажет;

· А ерітіндісінің 24 бөлігін Б ерітіндісінің 10 бөлігімен араластыру керек;

· алынған ерітіндінің тығыздығын ареометрмен өлшеу керек;

· тоңазытқышта t=+4ºC сақталады.

Тығыздық градиенті ерітіндісін дайындау үшін визотраст қолдануға да болады. Визотрасттың 6 бөлігіне тығыздығы 1,077 г/мл бидистиллирленген судың 6 бөлігі қосылады.

3) 0,2% трипан көгі ерітіндісі (бояу):

· 200 г трипан көгін өлшеп;

· 100 мл ыстық (80-90º) натрий хлориді ерітіндісінде ерітіледі;

· магнитті араластырғышта 10 минут араластыру керек;

· сүзгі қағазынан өткізу қажет;

· тығыз жабық қараңғы ыдыста бөлме температурасында сақталады. Қолдану алдында мақтаның жұқа қабатынан өткізіп қайта сүзү керек.

Антикоагулянт – гепарин мен ЭДТА қоспасын дайындау:

· 200 ЕД/мл гепариннің 1 бөлігін 6% ЭДТАның 2 көлемімен араластыру керек;

· тоңазытқышта t=+4ºC сақталады.

· 1:10 ара қатыста қанмен бірге (1 мл антикоагулянт + 10 мл қан) қолданылады.

Цитратты гемостабилизатор дайындау (тромбоциттердің агрегациялануының алдын алу үшін):

· 1,3 г тринатрий-цитрат, 4,8 г лимон қышқылы, 25 г глюкоза өлшенеді;

· стерилді дистиллирленген сумен 1 литрге дейін жеткізіледі. Оптималді көрсеткіші – рН 6,5;

· тоңазытқышта t=+4ºC сақталады.

1:7 қатынаста лейкоцитарлық қорытпамен бірге.

Анализді жүргізу техникасы.

Екі кезеңнен тұрады:

1. лимфоциттер популяциясын бөліп алу;

2. ЦТС қою.

1- кезең - лимфоциттер популяциясын бөліп алу:

· қан араласқан антикоагулянтты БФЕ 2 рет қосып, жаймен араластыру керек;

· қанмен 1:1 немесе 1:2 ара қатыста 1,077-1,078 г/мл тығызыдық градиенті ерітіндісін пробирканың қабырғасымен жаймен қабаттау керек;

· 400 g/мин (1500 айн/мин) 15-30 минут горизонталды роторда (бакет-ротор) айналдырылады;

· моноциттер қабатының орналасуын анықтау;

· дозатор немесе стерилді пастер пипеткасымен тығыздық градиенті мен араласқан қанның шекарасындағы мононуклеарлардан (лимфоциттерден) тұратын сақинаны жаймен алып, басқа пробиркаға салу керек;

· мононуклеардердың қоспасын Хенкс ерітіндісімен немесе 199 ортамен (3 мл-ден) 10 минут 1000 айн/мин айналдырып үш рет жуу керек:

· айналдырғаннан соң 1мл тұнбаны қалдырып, қалғанын (2 мл) төгіп тастау керек;

· плазманы гумаралдық иммунитетті бағалау үшін алып қою керек (қажет болса);

· бөліп алынған жасушаларға цитратты гемостабилизатор қосылады (стабилизатордың 1 бөлігі және лейкоцитарлық қоспаны 7 бөлігі);

· алынған жасушалардың санын жалпы зертханалық әдіспен Горяев камерасында санау керек;

· жасушалардың саны 2х10⁶ мл-ден аспауы тиіс (80% көп емес);

· лимфоциттердің тіршілік қабілеті 0,2-0,5% трипан көгі ерітіндісін лимфоциттердің қорытпасына қосу 1:1 (100 мкл + 100 мкл) арқылы анықталады:

· комплементті (қояндікі немесе теңіз шошқасынікі) инструкцияда көрсетілген титрмен араластыру қажет;

· дайын (коммерциялық) қарсы-Т-сары суды 199 ортамен жұмыс концентрациясына дейін (этикеткада көрсетілген) араластыру керек.

2- кезең - ЦТС жүргізу:

· полистиролды планшеттің ойықтарында (немесе центрифуганың пробиркаларында) 60 мкл қарсы–Т-сары суға жұмыс араласпасын, үгілерден алынған 200 мкл лимфоциттердің қорытпасын, 20 мкл комплементті қосу керек;

· бақылау ойығына (пробиркаға) 200 мкл лимфоциттердің қорытпасын, 20 мкл комплементті және 60 мкл 199 ортаны (бақылау үлгілері) енгізу қажет. Кейін әрбір пробиркаға 100 мкл трипан көгін қосып, бөлме температурасында 30-60сек. ұстау керек.

Нәтижелерді есептеу:

· Горяев камерасында тәжірибе («Т») және бақылау («Б») үлгілеріндегі мерт болған жасушаларды санау керек;

· препараттағы жасушалардың жалпы санынан олардың пайызын анықтау қажет;

· бақылаудағы мерт болған жасушалардың пайызын есептеу керек;

· төмендегі формула бойынша цитотоксикалық индексін (ЦТИ) анықтау керек:

ЦТИ = 100 х «Т» мерт болған жасушалардың % – «Б» мерт болған жасушалардың %

100 – «Б» мерт болған жасушалардың %

ЦТИ Т-антигендері бар жасушалардың пайызын, яғни Т-жасушалардың салыстырмалы санын көрсетеді. Сау адамдарда ЦТИ 70,6±0,9% құрайды.

8 кесте

Лимфотоксикалық сынаманы жүргізгенде кездесетін қателер

Тәжірибелік сабақ 13

ТАҚЫРЫП: Иммундық реттеу. СD₄,СD₈, Т-лимфоциттер. Анықтау әдістері.

Сабақтың жоспары:

1. Иммунорегуляция механизмі.

2. Т-лимфоциттер. Дифференциациялануы.

3. Анықтау әдістері (магниттік сепарациялау әдісі және иммундық ферментті әдіс).

4. СD₄, СD₈ лимфоциттерді анықтау.

5. Реакцияның компоненттері.

6. Сапасын бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· сараптама үшін реактивтерді дайындай білу;

· жасушаларды бояй білу;

· боялған ядроларды Горяев камерасында санай білу;

· СD₄, СD₈ Т-лимфоциттерін магнитті сепарациялау әдісімен анықтау барысында MPS-S магнитті сепараторымен қолдана білу;

· жарық немесе флюоресцентті микроскоппен қолдана білу;

· пипеткалық дозатормен қолдана білу;

· ИФТ әдісімен СD₄, СD₈ анықтау кезінде планшеттің ойықтарына стандартты және үлгілерді дұрыс енгізе білу;

· вертикалді фотометрде жұмыс істей білу;

· сапаны бақылауды жүргізе білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Т-лимфоциттердің бетінде СD деп белгіленетін дифференциациялық антигендер орналасады. Олар детерминант кластерлері (CD) деп аталады:

CD₃ – жетілген Т-лимфоциттердің бетінде;

CD₄ –Т-хелперлердің бетінде;

CD₈ – Т-киллерлердің бетінде;

CD₁₆ – NK-жасушалардың, T-киллерлердің маркерлері;

CD₄ және CD₈ – Т-лимфоциттердің негізгі субпопуляцияларын сипаттайды.

CD₄ иммундық жауапты реттеуші (хелперлер, көмекшілер) қызметін атқарады. Хелперлер Т- және В-лимфоциттерді қамтиды – жасушалық және гуморалдық иммунитетті іске қосады (40-45%). CD₈ – супрессорлық және цитотоксикалық қасиетке ие. Супрессорлар жасушалық және гуморалдық иммунитетті тежейді (30%).

Т- және В-лимфоциттерді және олардың субпопуляцияларын анықтауиммунтапшылық жағдайларды диагностикалауда және емін бақылауда, лимфопролиферативтік, ауыр жұқпалы ауруларды диагностикалауда, мүшелерді көшіруден кейінгі жағдайды, иммуносупрессорлық емдеуді бақылауда және басқа ауруларды диагностикалауда аса маңызды болып табылады.

Т-лимфоциттердің субпопуляцияларын анықтаудың әртүрлі әдістері бар:

1. магнитті сепарциялау әдісімен жарық микроскопын қолданып («БиоХимМак», Москва) CD₄ және CD₈ сандық анықтау;

2. иммундық басып алу әдісімен (ИФА), БИО-РАД, Москва CD₄ және CD₈ анықтау.

Магнитті сепарациялау әдісімен CD4⁺ және CD8⁺ абсолюттік санын анықтау

Әдістің принципі.

Тұтас қаннан CD4⁺ және CD8⁺ Т-лимфоциттерін бөліп алу CD4 және CD8 спецификалық жасушалық маркерлеріне қарсы антиденелермен конъюгацияланған парамагнитті полистиролды микробөлшектерді қолнауға негізделген. Мөлшері мен пішіні бойынша бірдей диаметрі 4,5 мкм біркелкі микросфераларды қолдану жасушардың тез және нәтижелі байланысуын қамтамасыз етеді және бейспецификалық байланысты төмендетеді.

Бұл әдіс CD4 және CD8 Т-жасушаларын тез және арзан бағада бөліп алуға қолайлы.

Әдістің экономды және нәтижесі жоғары болуы төмендегі көрсеткіштермен анықталады:

· тығызыдық гардиентінде айналдыру кезеңдері жоқ;

· тұтас қаннан жасушаларды бөліп алу 95% жоғары;

· CD4⁺ моноциттерінің әсерінің болмауы;

· бөлініп алынған фракцияның тазалығы 99% құрайды;

· ағымды цитометрия әдісімен корреляцияланы коэффициенті 90% жоғары;

· динамикалық диапазоны кең 10÷1500 жасуша/мкл;

· сараптау уақыты – 1 сағат;

· қымбат жабдықтарды талап етпейді;

· сараптаманың бағасы төмен.

Реактивтер мен жабдықтар:

· магниттік сепарация әдісімен CD4 және CD8 абсолюттік санын анықтауға арналған тест-жүйесі анализге қажетті барлық компоненттерді қамтиды.

· Dynal MPC-S магниті;

· араластыру үшін аспап (вортекс);

· 10х25 немесе 10х40 көлемге үлкейтетін зертханалық микроскоп;

· 2 мл «эппендорф» типті домалақ түпті пробиркалар;

· қан жинау үшін антикоагулянты бар (ЭДТА) пробиркалар;

· Горяев камерасы шыныларымен;

· 40, 200 және 1000 мкл ауыстырмалы автоматтық пипеткалар.

Реактивтерді дайындау.

1) Жұмыс ерітіндісі – 10 мл концентрацияланған фосфатты-тұзды буфер:

· 90 мл дистиллирленген су;

· 0,5 г натрий цитраты;

· толық ерігенше араластыру керек;

2) Лизистеуші ерітінді:

· 1000 мл 0,9% стерилді NaCl ерітіндісіне 20 мл цитримид ерітіндісі (гексадецилтримстиламмониумбромид, 50 мг/мл 90% NaCl), 10 мл формальдегид, 5 мл концентрацияланған сірке қышқылы қосылады.

3) бояу ерітіндісі:

· 0,025 г генцианвиолет;

· 2 мл концентрацияланған сірке қышқылы;

· 100 мл дистиллирленген су.

Анализді жүргізу техникасы.

1-ші кезең – сынама дайындау – тұтас қанды фосфат буферімен араластыру керек: 125 мкл қан + 350 мкл буфер.

2-ші кезең – моноциттерді жою:

· 25 мкл 2 рет араласқан Dynabeads CD 4 қанның араласқан үлгісіне қосу керек;

· шайқай отырып, 10 минут бөлме температурасында инкубациялау керек;

· Dynal MPC-S магнитінде 2 минут сепарацияланады;

· құрамында моноциттер жоқ супернатантты екі белгі қойылған пробиркаларға алу керек.

3-ші кезең - CD4 және CD8 Т-лимфоциттерін бөліп алу:

· Dynabeads CD4 және Dynabeads CD8 25 мкл-ден екі пробиркаларға салу керек;

· шайқай отырып, 10 минут бөлме температурасында инкубациялау керек;

· 2 минут сепарацияланады;

· бөліп алынған жасушаларды фосфат буферінде жуу керек.

4-кезең – бөліп алынған жасушаларды микроскопта санау:

· лизистеуші сірке қышқылында бөліп алынған жасушаларды ресуспензиялау қажет:

· 5 минут бөлме температурасында инкубациялау керек;

· генцианвиолет немесе акридин қызғыш (оранж) бояғыш ерітіндісін қосу керек;

· жарық немесе флюоресцентті микроскоппен Горяев камерасында боялған ядроларды санау керек.

Анализ нәтижелерін есептеу.

Боялған ядролар Горяев камерасының 20 үлкен төртбұрышынды (көлемі 0,4 мкл) саналады. Горяев камерасындағы үлкен төртбұрыш – бұл көлемі 1/25 мм² болатын 4 төртбұрыш.

Лимфоциттердің абсолюттік саны есептелген ядролардың санын 7,7 факторына көбейткенде 1 мкл тұтас қандағы жасушалармен есептеледі.

Әдістің сапасына бақылау жүргізілуі тиіс.

ИФТ әдісімен CD4⁺ және CD8⁺ санын анықтау

ИФТ әдісінің принципі. Әдіс басып алушы антиденелермен қапталған парамагнитті бөлшектердің көмегімен CD4 және CD8 Т-лимфоциттерін спецификалық басып алуға негізделген.

Реактивтер мен жабдықтар. ИФТ әдісімен CD4 және CD8 лимфоциттерін анықтауға арналған тест-жүйесі (дайын, коммерциялық) сараптау үшін қажетті барлық компоненттермен қамтылған:

· анти-CD2 моноклондық Ад (тышқандікі, парамагнитті бөлшектермен қапталған);

· белгілі концентрациядағы төрт стандарты бар парамагнитті бөлшектер: CD4 (RACD4, RBCD4, RCCD4, RDCD4) және CD8 (RACD8, RBCD8, RCCD8, RDCD8);

· адамның плазмасы;

· конъюгаттың анти-СD4 және анти–CD8 концентрацияланған ерітіндісі, тышқанның пероксидазамен белгіленген анти-СD4 және анти–CD8 моноклонлық Ад;

· жуу ерітіндісінің концентраты;

· субстратты буфер және хромогенді ерітіндінің концентраты;

· 12 «стриптері» бар плашкілер, магнит рамка.

Реактивтерді дайындау:

· жуу үшін ерітіндіні дайындау (аралстыру титрі флаконда немесе нұсқауда көрсетілген);

· стандарттарды араластыру: CD4 және CD8 стандарттары бар әрбір флаконға 0,9 мл жуу ерітіндісін құйып, әр флаконға 100 мкл плазма қосу керек. Одан кейін жаймен шайқалады. Стандарттар пайдалануға дайын;

· конъюгаттарды жуу ерітіндісімен араластыру (зерттелетін үлгілердің мөлшеріне қарау): мысалы, 7 үлгіні сараптау үшін 1080 мкл жуу ерітіндісі + 120 мкл конъюгат концентраты = 1,2 мл; 11 үлгіні сараптау үшін 1530 мкл жуу ерітіндісі + 170 мкл конъюгат концентраты = 1,7 мл;

· бланк ойықтарына енгізу үшін ерітінділерді араластыру: пробиркада парамагнитті бөлшектермен қапталған 500 мкл анти- CD2 моноклондық Ад және 100 мкл плазманы аралыстыру керек. 10 минут шайқау қажет. Ойықтарға енгізуден алдын тағы да шайқау керек;

· науқастардың тұтас қанының зерттелетін үлгілерін араластыру: пробиркада парамагнитті бөлшектермен қапталған 500 мкл анти- CD2 моноклондық Ад және 100 мкл тұтас қанның үлгісін аралыстыру керек. 2 минут шайқау қажет. Үлгілер зерттеуге дайын;

· субстратты араластыру (реакция жүргізу үшін). Хромоген концентратын субстрат буферімен араластыру керек (үлгілердің мөлшеріне қарай): мысалы, 7 үлгіні сараптау үшін 2450 мкл субстрат буфері + 50 мкл хромоген = 2500 мкл; 11 үлгіні сараптау үшін 3430 мкл субстрат буфері + 70 мкл хромоген = 3500 мкл. Ерітіндінің тұрақтылығы – 6 сағат.

Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 1213 | Нарушение авторских прав