АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

СОЦИАЛЬНАЯ ГЕРОНТОЛОГИЯ 8 страница

Анализді жүргізу техникасы:

· планшетті магнитті рамкаға қою керек;

· CD4 және CD8 арналған сәйкес ойықтарға стандарттарды, бланк және науқастардың қан үлгілерін енгізу керек. Енгізілетін ерітінділердің мөлшері мен схемасы тест-жүйесінің нұсқауында көрстеліген;

· 2 минуттан кейін ойықтардағы құрамдарды сорып алып, дезерітіндісі бар контейнерге салу және үлгілер бар планшетті екі рет жуу ерітіндісімен шаю керек;

· планшетті магнитті рамкадан алып, тез қажетті ойыққа 100 мкл-ден анти-CD4 және анти-CD8 араласқан конъюгат қосу керек. Планшетті пленкамен жабу керек;

· 20 минут±2 минут бөлме температурасында инкубацияланады;

· планшетті магнитті рамкаға қойып, содын кейін пленканы шешу керек;

· 2 минуттан кейін 200 мкл жуу ерітіндісін енгізіп, үлгілері бар планшетті тағы да төрт рет шаю керек (барлығы 5 рет шаю қажет);

· ойықтардағы құрамды сорып алып, магнитті рамкада шығару керек;

· әр ойыққа тез 100 мкл-ден субстрат енгізу керек;

· 20 минут±2 минут қараңғы жерде бөлме температурасында инкубацияланады (планшетті пленкамен жабу қажет емес);

· инкубациядан кейін магнитті рамканы қойып, 2 минуттан кейін барлық ойықтарға 50 мкл-ден стоп-реагент қосу керек.

Нәтижелерді есептеу және сапасын бақылау: вертикалді фотометрде оптикалық тығыздықты өлшеу керек.

Қажетті бағдарламаны қолданған жағдайда CD4 және CD8 алынған санымен калибрлік қисық сызуға болады. Шухарт картасын пайдалана отырып, сарапаманың дұрыс орындалуына және нәтижесіне баға беруге болады.

Қалыпты жағдайда моноклондық Ад-мен жасалған ИФТ әдісінде CD4 салыстырмалы құрамы – 30-60%; CD8 – 15-38%; абсолюттік құрамы - CD4 – 600-1900 мкл; CD8 – 300-800 мкл; CD4/CD8 қатынасы (есеп көрсеткіші) 1,02±0,1%.

Болуы мүмкін қателердің алдын алу үшін келесі талаптарды орындау қажет:

1. Барлық реактивтер инструкция бойынша дайындалуы қажет.

2. Жуу кезеңдерін инструкция бойынша орындау керек.

3. Инкубациялау және магнитті сепарациялау уақыттарын сақтау қажет.

4. Сапалы пипеткалы дозаторларды қолданған жөн.

5. Магнитті дұрыс пайдалану керек.

Тәжірибелік сабақ 14

ТАҚЫРЫП: Иммундық реттеу. Моноклондық антиденелермен Т-лимфоциттердің субпопуляцияларын сандық анықтау.

Сабақтың жоспары:

1. Әдістің принципі.

2. Реактивтер мен жабдықтарды дайындау.

3. Лейкоқорытпаны дайындау.

4. Анализді қою техникасы.

5. Сапасын бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· реактивтерді дайындай білу;

· лейкоқорытпаны дайындай білу;

· центрифугамен жұмыс істей білу;

· люминесцентті микроскоппен немесе ағын флюориметрмен жұмыс істей білу;

· сапасын бақылау.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Иммундық компетентті жасушалар санының өзгеруі және әртүрлі популяциялар ара қатысытарының бұзылуы көптеген ауруларда кездеседі.

Әдістің принципі.

Т-лимфоциттердің бетінде дифференциациялық антигендер (CD) болады: CD3 – жетілген Т-лимфоциттердің бетінде; CD4 – Т-хелперлердің бетінде; CD8 - Т-киллерлердің бетінде; CD16 - NK-жасушалардың, Т-киллерлердің бетінде; CD20, CD22 - В-лимфоциттердің бетінде орналасады.

Лимфоциттерге фиколл-верографиннің тығыздық градиентінде (1,077) бөлініп алынған сәйкес детерминанттарға қарсы моноклондық антиденелерді қосқанда жасушалардың бетінде «иммундық комплекс» пайда болады, бұл конъюгатты (ФИТЦ-пен белгіленген тышқанның Ig қарсы антиденелер) қосу арқылы байқалады. Моноклондық антиденелермен жасалатын тікелей емес иммунофлюоресцения реакциясы.

Субстанциялардың саны люминесцентті микроскопта сәулеленген жасушалардың пайызын есептеу арқылы анықталады.

Реактивтер мен жабдықтар:

· люминесцентті микроскоп немесе ағын флюориметр;

· люминесцентті микроскопқа иммерсиялық май;

· шынылар;

· центрфуга;

· фосфатты-тұзды буфер ерітіндісі рН 7,2-7,4;

· фиколл-верографин ерітіндісі, тығыздығы – 1,077;

· моноклондық антиденелер;

· ақ тышқанның иммуноглобулиндеріне қарсы конъюгат (ФИТЦ-пен белгіленген).

Реактивтерді дайындау:

· тығыздығы 1,077 фиколл-верографин дайындау: 9 г фиколлды өлшеп, стаканға салу керек. Үстіне 100 мл қайнаған су (70ºС) құйылады. Фиколл ерігеннен кейін 150 мл-ге дейін цилиндрге құю керек. Шыны таяқшамен араластыра отырып, ампуладан верографинді тығыздығы 1,077 болғанша құйылады. Тығыздығын депситометрмен қадалау керек. Ерітіндіні таза ыдыста пайдаланғанға дейін t=+4ºC мұздатқышта, ұзақ сақтаған жағдайда t=-20ºC мұздатқышта;

· венаден гепарині бар шприцке алынған қанды (10 мл қанға 200 ЕД гепарин) пробиркада бөлме температурасына қою керек. 30-40 минуттан соң лейкоқорытпасын жинап алу керек;

· моноклондық антиденелерді инструкцияға сәйкес еріту керек (t=+4ºC мұздатқышта сақталады).

Анализді жүргізу техникасы:

· центрифуганың таза пробиркаларына 1,5 мл-ден фиколл-верографин енгізіледі;

· оның үсітен ұқыптап 2-2,5 мл-ден лейкоқорытпаны немесе фосфатты-тұзды буфермен 2 рет араластырылған тұтас қанды қабаттап құю керек;

· пробиркаларды 30 минут бойы 1500 айн/мин айналдыру қажет. Одан кейін қан мен фиколл-верографиннің шекарысында ақ сақина (лимфоциттерге бай суспензия) пайда болады;

· лимфоциттерді (сақина) жақсылап жинап таза пробиркаға салу керек;

· лимфоциттерді фиколл-верографиннен фосфатты-тұзды буфермен тазалау керек. Бұл мақсатта лимфоциттер бар пробиркаға 7-10 мл-ге дейін ФТБ ерітіндісін қосып, 10 минут 1000 айн/мин айналдыру қажет (одан көп жылдамдықта жасушалар іриді);

· супернатантты дезерітіндісі бар ыдысқа салу керек;

· лимфоциттерді қайта жуу керек;

· кішкентай пластмасса дөңгелек түпті пробиркаларға 20 мкл-ден сәйкес детерминанттарға қарсы моноклондық антиденелерді енгізу керек;

· лимфоциттерді соңғы рет жуғаннан кейін супернатантты төгіп тастап, лимфоциттердің тұнбасын 0,25-0,3 мл-ге (моноклондардың мөлшеріне қарай) ресуспензиялау қажет;

· моноклондық антиденелері бар пробиркаларға 500 мкл-ден лимфоциттер суспензиясын қосу керек;

· пробиркаларды 20-30 минут t=+4ºC тоңақытқышта инкубациялау керек. Бұл кезде лимфоциттердің бетінде иммундық комплекс (моноклондық антиденелер және сәйкес CD) пайда болады;

· инкубациядан соң лимфоциттерді екі рет ФТБ-мен жуыдады: бұл үшін пробиркаларға 1,5-2 мл ФТБ қосып, 3 минут 1500 айн/мин айналдыру қажет. Супернатантты төгіп тастау керек. Тұнбаны супернатанттың қалған тамшыларында ресуспензиялау керек;

· лимфоциттер суспензиясына лимфоциттердің бетінде пайда болған иммундық комплекстерді байқау үшін 50 мкл ФИТЦ – конъюгатты қосылады;

· 20-30 минут t=+4ºC тоңазытқышта инкубациялау керек;

· инкубациялаудан кейін лимфоциттерді байланыспаған конъюгаттардан тазарту қажет (1,5-2 мл ФТБ қосып, 3 минут 1500 айн/мин айналдыру қажет). Жуып болған соң супернатантты алмай, пробиркада қалдыру керек;

· препараттарды дайындау қажет: лимфоциттері бар екі пробирканы алып, супернатантты төгу керек. Лимфоциттер тұнбасын ресуспензиялап, 20 мкл-ден шыныға салу керек (1 шыныға 2 препараттан). Суспензияның тамшысын жабқыш шынымен жауып, люминесценциялау үшін үстіне иммерсиялық майды тамызу қажет.

Нәтижелерді есептеу.

Люминесцентті микроскопта жарық лампасының көмегімен көру аймағындағы лимфоциттерді санау керек. Кейін лампаның жарығын жауып, осы аймақтағы сәулеленген жасушаларды (тек қана беткей мембрана қалпақ, жартылай ай, жіңішке сызық түрінде сәулеленеді) санап шығу керек;

· 200-300 лимфоциттер ішінде сәулеленген жасушалардың пайызын есептеу керек;

· науқастың қанындағы лимфоциттердің абсолюттік санын біле отырып, берілген жасушалардың субпопуляцияларының пайызын абсолюттік санға қайта есептеп шығу керек.

Сапаны бақылау.

Шухарттың картасында анализдің дұрыс жасалуы мен нәтижелерін тексеру керек.

Тәжірибелік сабақ 15

ТАҚЫРЫП: Иммундық патологиялар. Аллергиялық реакциялар. ИФТ әдісі. Жалпы IgЕ анықтау.

Сабақтың жоспары:

1. IgЕ синтезінің негізгі механизмдері.

2. ИФТ әдісінің принципі.

3. Реактивтер мен жабдықтарды дайындау.

4. ИФТ жүргізу техникасы.

5. Нәтижелерді есептеу.

6. Калибрлік қисықтарды сызу.

7. Сапасын бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· реактивтерді дайындай білу;

· вертикалді фотометрмен (Мультискан) жұмыс істей және бағдарлама жасай білу;

· нәтижелерді қолмен есептегенде калибрлік қисықты сыза білу;

· сапасын бақылай білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Сары суда, плазмада немесе басқа биологиялық сұйықтықтарда IgЕ жалпы деңгейін (МЕ/мл) сандық анықтау гуморалдық иммунитетті зерттеуде, иммунтапшылық жағдайларды, паразиттік ауруларды, парапротеинемияларды және әсіресе аллергиялық ауруларды диагностикалауда өте маңызды болып табылады.

IgE-антиденелерімен «қаруланған» жасушалар – ұлпалардағы мес жасушалар және қандағы базофилдер макрофагтар мен гранулоциттерге қарағанда «өзінің» антигендерін тез танып, күшті әсерлеседі.

IgE жүйесі басқа иммуноглобулиндердің синтезіне қарағанда ерекше болып табылады. Жалпы IgE анықтау әдісі диагноздарды ажырату, ауруды болжау, емдеуді бақылау үшін қолданылады.

Жалпы IgE анықтаудың бірнеше әдістері бар: бәсекелесті радиоиммундық, екі антиденені байланыстырумен жүретін (сэндвич-тест) иммунорадиометриялық, IgE қарсы моно- және поликлондық антиденелерге негізіделетін сэндвич-тест әдістері, ИФТ қарапайымдастырылған түрі (латекс-тест, иммунохроматография). Көп тараған әдіс ИФТ.

Әдістің принципі:

Сэндвич қатты фазалы ИФТ-ң моноклондық антиденелерге негізделген түрі. IgE қарсы МкАд-пен сенсибилизацияланған полистиролды планшет қолданылады. Барлық үлгілер планшеттің ойықтарына енгізіледі, кейін оларға хрен пероксидазасы бар IgE қарсы моноклондық антиденелердің конъюгаты қосылады. Байланысқан конъюгаттың мөлшері субстрат ерітіндіні жуып, қосқан соң анықталады. Боялу қарқыны зерттелетін үлгілердегі IgE деңгейіне пропорционалды.

Реактивтер мен жабдықтар:

· жалпы IgE сандық анықтауға арналған дайын коммерциялық тест-жүйе, құрамында бақылау сары су, белгілі құрамда МЕ/мл IgE бар калибраторлар, ферментпен белгіленген МкАд (конъюгат), субстратты қоспа, стоп-реагент, жуу ерітіндісі бар;

· 37ºС термостат;

· вертикалді фотометр (Мультискан);

· ауыстырмалы пипеткалы дозаторлар, бір реттік ұштықтарымен;

· шейкер (сілкігіш).

Реактивтерді дайындау:

· қолданудан алдын тест-жиынтықты бөлме температурасында 30 минут ұстау керек;

· айқындағыш ерітіндіні қолданудан 10 минут бұрын инструкция бойынша дайынау керек;

· планшеттерді жууға арналған 10-еселік тұзды концентратты дистиллирленген сумен нұсқау бойынша араластыру керек.

Анализді жүргізу техникасы:

· планшеттің ойықтарына дубльде калибраторларды, бақылау сары суын және 20 мкл-ден зерттелетін сынамаларды енгізу керек. А1 және В1 ойықтарына «О» калибраторын енгізу керек – бұл ойықтар бланк болып есептеледі;

· барлық ойықтарға бірден 100 мкл-ден конъюгат енгізу қажет;

· 20-30 сек шейкерде араластырып, планшетті пленкамен жауып, 1,5 сағат бойы 37ºС термостатта инкубациялау керек;

· инкубациялағаннан соң планшетті төрт рет 200 мкл-ден жуу ерітіндісімен шаю қажет. Ерітіндінің қалдықтарын сүзгі қағазға сілку керек;

· барлық ойықтарға 150 мкл-ден проявляющий ерітінді қосып, 15 минут бойы 37ºС термостатта инкубациялау керек:

· әр ойыққа 50 мкл-ден стоп-реагент қосу керек;

· 450 нм мультисканда енгізілген сынамалардың оптикалық тығызыдығын өлшеу керек.

Нәтижелерді есептеу:

· жиынтықта стандарттар мен «Мультискан» фотометрі болған жағдайда сызықтық интерполяция әдісімен үлгілердегі жалпы IgE концентрациясы (МЕ/мл) автомат түрде есептеледі;

· IgE құрамын анықтауға анықтау мүмкіндігі болмаған жағдайда калибратордағы IgE концентрациясына оптикалық тығыздықтың байланысы бойынша калибрлік қисық сызу қажет, абсцисс осіне IgE концентрациясы (МЕ/мл), ал ординат осіне соған сәйкес оптикалық тығыздықтың көрсеткіштері қойылады;

· Калибрлік кестені қолдана отырып, зерттелетін үлгілерде жалпы IgE құрамының көрсеткіші табылады. Калибрлік қисықты сызу алдыңғы сабақтарда берілген.

Ересек адамдарда жалпы IgE деңгейі – 150 МЕ/мл.

Сапасын бақылау.

Алдын ала салынған Шухарт картасына бақылау сары суының көрсеткіші бейнеленеді.

Тәжірибелік сабақ 16

ТАҚЫРЫП: Иммундық патологиялар. Аллергиялық реакциялар. ИФТ әдісі. Аллергоспецификалық IgE анықтау.

Сабақтың жоспары:

1. IgE-тәуелді аллергиялық реакциялардың негізгі механизмдері.

2. Спецификалық IgE анықтау бойынша ИФТ әдісінің принципі.

3. Анализді жүргізу техникасы.

4. Нәтижелерді есептеу.

5. Сапаны бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· сараптауға арналған үлгілерді дайындай білу;

· реактивтерді дайындай білу;

· нәтижелерді талдау шкаласымен қолдана білу;

· алынған нәтижелерге баға бере білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау:

· аллергиялық ауруларда антигенмен (аллергенмен) қайта кездескенде IgE рецепторларға ие мес жасушалардың, базофилдердің бетінде «Ад + IgE» иммундық комплексі түзіледі. Нәтижесінде мес жасушалар белсеніп, дегрануляцияланады және көп мөлшерде биологиялық белсенді заттар (медиаторлар) бөлініп шығады;

· сары судағы жалпы IgE санын анықтау симптомдары мен орналасуы ұқсас аллергиялық және аллергиялық емес ауруларды ажыратуда жалғыз және негізгі көрсеткіш емес. Тек спецификалық IgE диагностикалық конценртрациялары байқалғанда ғана тез дамитын аллергияның болуын білдіреді;

· аллергендерге қарсы спецификалық IgE анықтауға арналған әртүрлі тест-жүйелер бар: ИФТ, радиоиммундық, иммунохемилюминесцентті әдістер. Соның ішінде біреуінде, яғни «Иммунодоте ИФТ» тоқталайық.

Әдістің принципі – қатты фазалы, екі кезеңді ИФТ. Бес аллерген (тағамдық, тозаңдық, эпидермалді, тұрмыстық немесе саңырауқұлақ аллергендері), сондай-ақ, бақылаулар (оң, теріс мәнді) нүкте түрінде индикаторлық жолдардың полистиролды бетіне қондырылады. Бірінші инкубация кезінде сары судың IgE антиденелері сәйкес аллергендермен байланысады. Байланыспаған компоненттерінен тазартылады. Екінші рет инкубациялауда IgE байланысқан молекулаларына пероксидазамен конъюгацияланған тышқанның анти-IgE-моноклондық антиденелері қосылады. Байланысқан ферментті шайып болған соң хромогенмен жасалатын түсті реакцияның көмегімен айқындайды. Аллергеннің боялу қарқыны сол аллергенге қарсы спецификалық IgE антиденелерінің құрамына тура пропорционалды.

RAST топтарына сәйкес бояуларды талдау карточкасы бойынша визуалды бағаланады.

Реактивтер мен жабдықтар:

· барлық қажетті компоненттерімен дайын тест-жүйе;

· қақпағы бар инкубациялық камера;

· бір каналды жартылай автомат пипеткалар ауыстырмалы ұштықтармен;

· амплитудасы 2 см және жылдамдығы 80 бір/мин горизонталды шейкер;

· 100 мл өлшегіш колба;

· сүзгі қағазы.

Реактивтерді дайындау:

· физиолоиялық ерітінді (0,9% NaCl) дайындау керек;

· жуу ерітіндісін дайындау керек. 10 мл концентрацияланған жуу ерітіндісіне 90 мл дистиллирленген суды қосып, араластыру керек;

· айқындағыш ерітінді дайындау керек. Өлшегіш колбаға 10 мл дистиллирленген суды құйып, оған 400 мкл хромоген ерітіндісін және 100 мкл субстратты буфер қосып керек. Араластырылады. Ерітіндінің тұрақтылығы - 1 сағат.

Анализді жүргізу техникасы:

· тағамдық, тозаңдық, эпидермалді, тұрмыстық немесе саңырауқұлақ аллергендерінің индикаторлық жолдарын инкубациялық камераға салу керек. Белгілеу қажет;

1 – ш і и н к у б а ц и я:

· 1,0 мл зерттелетін сары суды аллерген бар камераға енгізу керек. Инкубациялық камераны жауып, 2 сағат бойы бөлме температурасында шейкерде араластыра отырып инкубациялау керек;

· егер үлгінің мөлшері 1,0 мл-ден кем болса, сынаманы физиологиялық немесе жуу ертінділерімен 5 ретке дейін араластыруға болады және түн бойы инкубациялау қажет;

· инкубациялан соң ойықтың ішіндегіне төгіп тастап, 1,5 мл жуу ерітіндісін құйып, араластыра отырып 5 минут бөлме температурасында инкубациялау керек. Тағы да 2 рет жуу қажет.

2 – ш і и н к у б а ц и я:

· 1,0 мл конъюгат ерітіндісін камераға енгізу керек. Инкубациялық камераны жауып, 1 сағат бойы бөлме температурасында шейкерде араластыра отырып инкубациялау керек;

· инкубациялан соң 3 рет жуу қажет.

А й қ ы н д а у

· 1,0 мл айқындағыш ерітіндіні камераға енгізіп, 15 минут бөлме температурасында шейкерде араластыра отырып инкубациялау керек;

· инкубациялан соң ойықтың ішіндегіне төгіп тастап, 1,5 мл дистиллирленген су құю керек.

Нәтижелерді есептеу:

· жолдарды камерадан шығарып, сүзгі қағазымен құрағытып 30 минут кептіру керек;

· нәтижелер боялу қарқынын бояуды талдайдауға арналған карточкадағы түсті шкаламен салыстыру арқылы визуалды бағаланады. RAST тобының спецификалық IgE антиденелерінің құрамына салыстырмалы сәйкестенуі төмендегідей:

Тест-жүйесі тағамдық, тозаңдық, эпидермалді, тұрмыстық немесе саңырауқұлақ аллергендерге сенсибилизациялануды анықтауға мүмкіндік береді.

Сапасын бақылау. Анализдің дұрыс қойылуы оң және теріс мәнді бақылауларды бағалау арқылы анықталады.

Тәжірибелік сабақ 17

ТАҚЫРЫП: Иммундық патология. Аутоиммундық аурулар. ИФТ әдісі. Тиреоглобулинге қарсы антиденелердің санын анықтау.

Сабақтың жоспары:

1. Аутоиммундық аурулардың негізі механизмдері.

2. Тиреоглобулинге (Тг) және тиреопероксидазаға (ТПО) қарсы антиденелердің санын анықтау.

3. Реактивтерді дайындау.

4. ИФТ жүргізу техникасы.

5. Нәтижелерді зерттеу.

6. Сапаны бақылау.

Тәжірибелік дағдылар:

· реактивтерді (конъюгат, жуу ерітіндісі, субстратты қоспа, 10% күкірт қышқылы ерітіндісі) дайындай білу;

· калибраторларды дайындай білу;

· құйын тәрізді араластырғышпен жұмыс істей білу;

· спектрофотометрде жұмыс істей білу;

· сапасын бақылай білу.

Сабақты өтуге арналған нұсқау.

Қалқанша безінің аутоиммундық аурулары сары суды бір немесе бірнеше антигендерге қарсы антиденелердің болуымен сипатталады. Тиреоглобулинге қарсы аутоантиденелердің болуы қалқанша безінің жедел және жеделше ауруларының этиологиясында маңызды. Сау адамдарда антиденелердің құрамы – 100 МЕ/мл-ден кем.

Әдістің принципі.

Иммуноферментті талдау әдісі қолданылады. Планшеттің ойықтары тиреглобулинмен толтырылған. Ойықтарға науқастардың үлгілерін енгізген кезде «Ад+Аг» комплексі түзіледі. Плашкіде сорбцияланған антиген үлгілердегі антиденелермен байланысады. «Ад+Аг» комплексі адамның G иммуноглобулиніне қарсы тышқанның пероксидазасы бар моноклондық антиденелері конъюгаты арқылы анықталады.

Реактивтер мен жабдықтар:

· сараптама жасауға барлық компоненттері бар тиреоглобулинге қарсы Ад анықтауға арналған жинақ (дайын, коммерциялық);

· термостат;

· бір және көп каналды пипеткалар;

· құйын тәрізді араластырғыш;

· спектрофотометр;

· күкірт қышқылы.

Реактивтерді дайындау:

· конъюгатты дайындау: конъюгатты жуу ерітіндісімен араластыру керек. Сақтау мерзімі t=+2-8ºC 1 айдан көп емес;

· шаю ерітіндіні дайындау: 420 мл дистиллирленген суға 30 мл шаю ерітіндінің концентраты қосылады. Сақтау мерзімі t=+2-8ºC 1 айдан көп емес;

· 10% күкірт қышқылының ерітіндісін дайындау: 22,5 мл дистиллирленген суға 2,5 мл концентрацияланған күкірт қышқылы қосылады. Қышқылды суға жаймен қосу керек. Бөлме температурасында 2 ай сақталады;

· субстратты қоспаны дайындау;

· 6 калибрлік сынамаларды дайындау: 2000, 1000, 500, 250, 100, 0 МЕ/мл. Калибраторлар үлгілерді араластыруға арналған ерітіндімен араластырылады. Бөлме температурасында 0,5 сағат сақталады;

Анализді жүргізу техникасы:

· зерттеуден алдын жинақ пен үлгілерді бөлме температурасында 30 минут ұстау керек;

· үлгілерді дублмен енгізу қажет;

· бірінші 12 ойыққа 100 мкл-ден 6 калибраторларды дублмен енгізу керек;

· үлгілері бар ойықтарға 90 мкл-ден үлгілерді араластыруға арналған ерітінідіні және 10 мкл-ден зерттелетін сары суларыд енгізу керек;

· планшет 60 минут t=37ºC инкубацияланады;

· ойықтарды жуу ерітіндісімен 4 рет жуып, кептіру керек;

· кейін ойықтарға тез 100 мкл-ден конъюгат ерітіндісін енгізу керек;

· 30 минут t=37ºC инкубацияланады;

· ойықтарды жуу ерітіндісімен 4 рет жуып, кептіру керек;

· планшетті 4 рет жуу керек;

· ойықтарға тез 100 мкл-ден жаңа дайындалған субстратты қоспаны енгізу керек;

· 10 минут бөлме температурасында араластырмай инкубациялау керек;

· ойықтарға 100 мкл-ден 10% H₂SO₄ енгізу керек (реакцияны тоқтату үшін);

· 20-30 сек бөлме температурасында динамикалық шейкерде инкубацияланады.

Нәтижелерді есептеу.

Спектрофотометрде 492 нм оптикалық тығыздықты өлшеу қажет. Спектрофотометрде өлшеу бағдарламасын қолданған жағдайда тиреоглобулинге қарсы антиденелердің санын анықтауға болады. Мұндай мүмкіншілік болмаған жағдайда калибрлік қисық сызылып, зерттелетін үлгілердегі антиденелердің құрамы анықталады.

Сапасын бақылау.

Әрбір анализді орындағанда Шухарт картасында бақылау сары суларының көрсеткіштері қойылады.

Тәжірибелік сабақ 18

Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 950 | Нарушение авторских прав