АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы визуализации возбудителя.

Бактериоскопигеский метод — микро­скопия окрашенных мазков исследуемого материала больного имеет ограниченное применение и является вспомогательным лишь при ряде инфекций (менингококко-вая, лептоспироз, возвратный тиф).

Еирусоскопигеский метод — обнаруже­ние вируса при электронной микроскопии иссследуемого материала. В практике име­ет ограниченное применение.

Паразитологигеский метод является основным для диагностики паразитарных заболеваний (малярия, лямблиоз, аме-биаз, криптоспоридиоз, пневмоцистоз, лейшманиоз). В основе метода — микро­скопия специфически окрашенных и обо­гащенных мазков крови, экссудата, мок­роты, кала, биоптатов органов.

Методы выявления антигенов воз­будителя в сыворотке крови, секретах, вы­делениях или пораженных тканях исполь­зуют для ранней экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и ее модификация — реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) основаны на использовании явления люминесцен­ции при соединении антигенов бактерий,

24 -ν- общая часть

вирусов, риккетсий со специфическими антителами, меченными флюоресцирую­щими красителями (изотиоцианатом флу-оресцеина). При прямом методе (РИФ) на взятый от больного материал, содержащий антиген (например, мазки-отпечатки со слизистой оболочки зева при ОРВИ или микоплазмозе верхних дыхате­льных путей), наносят специфическую люминесцирующую сыворотку, содержа­щую меченые антитела.

При непрямом методе (РНИФ) с целью выявления антигена мазок-отпе­чаток обрабатывают специфической не­меченной сывороткой. Затем наносят лю­минесцирующую сыворотку к глобулинам немеченной сыворотки. Учет обеих реак­ций проводят под люминесцентным мик­роскопом. Метод прост, высоко чувстви­телен и позволяет получить ответ через несколько часов от начала исследования. РИФ и РНИФ применяют для ранней экспресс-диагностики гриппа и других ОРВИ, коклюша, микоплазменной и хла-мидийной инфекций, дизентерии, брюш­ного тифа, сальмонеллеза, чумы, туляре­мии, сифилиса, токсоплазмоза, бешенства, ВИЧ-инфекции.

Радиоиммунологигеский метод (РИМ), или радиоиммунный анализ (РИА) — вы­сокочувствительный метод, основанный на применении радиоизотопной метки ан­тигенов или антител (часто I¹²⁵). Обычно используют твердофазовый вариант РИМ, при котором антигены или антитела (в за­висимости от задачи исследования) ад­сорбируются на твердом носителе (цел­люлозе, полистироле). Сущность метода заключается в определении количества меченного радиоактивным йодом антиге­на после его контакта с гомологичными антителами сыворотки. Метод использу­ют для диагностики вирусных гепатитов, бактериальных, риккетсиозных и прото-зойных заболеваний. Для выявления ан­тигенов ВГВ к исследуемой сыворотке до­бавляют референс-сыворотку, содержа­щую антитела к вирусу гепатита В. Смесь

инкубируют 1—2 дня, затем добавляют к ней референс-антиген, меченный изото­пом I¹ и продолжают инкубацию еще 24 часа. К образовавшемуся растворимо­му комплексу антиген-антитело добавля­ют преципитирующие антииммуноглобу­лины против белка референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата. Результат реакции учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зареги­стрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связы­вающегося со специфическими антитела­ми референс-сыворотки, последние не вступают в связь с меченным антигеном, поэтому он не обнаруживается в преципи­тате.

Иммуноферментный анализ (ИФА) -высокочувствителен, легко воспроизво­дим и не требует радиоактивных реаген­тов, что делает его более доступным по сравнению с РИА. Принцип метода состо­ит в использовании антител, конъюгиро-ванных с ферментами (пероксидазой хре­на или щелочной фосфатазой),— конъю-гатов. Присоединяясь к образовавшимся на твердой фазе иммунным комплексам, конъюгат способствует их выявлению в результате реакции фермента с хромоген-ным субстратом (ортофенилендиамином, тетраметилбензидином). В качестве твер­дой фазы используют различные материа­лы — панели для титрования, палочки и шарики, нитроцеллюлозные мембраны. Модификация с использованием мембран получила название ELISA (enzime-linked immunosorbent assay). Результаты анализа учитывают визуально и инструментально (с помощью ИФА-ридеров) по оптиче­ской плотности окрашенных продуктов реакции.

Метод широко используют для опре­деления антигенов гепатита В в сыворотке крови, иерсиниозного антигена в кале, мо­че, слюне.

Полимеразная цепная реакция (ТЩР) — молекулярный метод диагностики. Сущ­ность метода заключается в многократ-

Диагностика инфекционных болезней -Ф- 25

ном копировании целевого фрагмента ДНК ферментом ДНК-полимеразой. Дан-ный-фермент может достраивать корот­кий участок ДНК, называемый прайме-ром, при условии, что праймер образовал комплекс с другой цепью ДНК. Это воз­можно, если первичная последователь­ность праймера соответствует первичной последовательности целевого фрагмента (они комплементарны). Реакция прохо­дит несколько циклов, в результате кото­рых количество точных копий целевого фрагмента увеличивается (амплифици-руется) экспоненциально (по крайней мере в 10⁵ раз) и многократно превышает количество всех остальных продуктов реакции.

Реакция проходит основные э т а -п ы: 1) пробоподготовка — быстрое, в те­чение 10 мин, выделение ДНК, готовой к амплификации (свободной от РНК, инги­биторов ДНК-полимеразы, белков) из цельной крови, тканей, суспензий клеточ­ных культур и бактериальных клеток; 2) амплификация; 3) анализ продуктов ПЦР методом электрофореза в геле; 4) до­кументирование результатов электрофо­реза.

Достоинствами метода являются вы­сокая чувствительность и специфичность, быстрота постановки. С помощью ПЦР можно верифицировать вирусные гепати­ты, диагностировать хламидиоз, мико-плазмоз, герпетическую инфекцию, корь, краснуху, инфекционный мононуклеоз, дифтерию, ВИЧ-инфекцию и др.

Методы обнаружения специфиге-ских антител. Методы серологической диагностики (обнаружение антител в сы­воротке крови) широко распространены. Однако они являются методами поздней и ретроспективной диагностики. Для боль­шинства серологических методов необ­ходимо исследование парных сывороток в динамике заболевания с интервалом 7—14 дней.

Оценка результатов серологического исследования в ряде случаев затруднена.

В частности, иммунологический ответ мо­жет быть недостаточно напряженным на фоне первичного или вторичного иммуно­дефицита, а также у детей раннего возрас­та, особенно недоношенных. Кроме того, у детей раннего возраста могут определять­ся материнские антитела, у привитых — поствакцинальные.

Необходимо также учитывать, что се­рологические реакции не являются абсо­лютно специфичными ввиду наличия об­щих антигенов у возбудителей, относя­щихся к одному и даже разным видам. Специфичность серологических тестов за­висит также от качества применяемых диагностикумов, правильности получе­ния, обработки и хранения исследуемых сывороток. Так, например, нельзя исполь­зовать для исследования сыворотки, име­ющие признаки бактериального загряз­нения, гемолиза, посторонние примеси, многократно замораживаемые и оттаива­емые, длительно хранящиеся при комнат­ной температуре.

Для серологической диагностики ин­фекционных заболеваний широко исполь­зуют РА, РЛА, ΡΗΓΑ, РСК и РТГА. Эти ре­акции чаще используют для обнаружения антител, но их можно применять и с целью выявления антигенов.

Реакцию агглютинации (РА) использу­ют для определения специфических анти­тел с помощью известного антигена, а так­же с целью установления вида микроба с помощью известных антител. Она широко используется для диагностики брюшного тифа (брюшнотифозный Видаль), стафи­лококковой инфекции (стафилококковый Видаль), иерсиниоза, бруцеллеза (реак­ция Райта, реакция Хеддлсона).

Модификация РА, при которой на носитель (частица латекса) наносят очи­щенные антигены, называется реакцией латексной агглютинации (РЛА). В на­стоящее время она применяется для диаг­ностики дифтерии, коклюша, ВИЧ-ин­фекции, менингококковой, гемофильной, пневмококковой и кишечных инфекций.

26 -Φ" ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Реакция непрямой гемагглютинации (ΡΗΓΑ) по чувствительности превышает реакцию агглютинации. Это достигается использованием эритроцитов, на поверх­ности которых сорбируются антигены (бактериальные и вирусные) или ан­титела. Эритроциты, сенсибилизирован­ные антигенами, называют антигенными эритроцитарными диагностикумами и ис­пользуют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизирован­ные антителами, именуют иммуноглобу-линовыми эритроцитарными диагности­кумами и применяют для выявления анти­генов.

ΡΗΓΑ широко используется для диа­гностики острых кишечных инфекций, коклюша, ОРВИ, дифтерии, боррелиоза и др.

Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации компле­мента комплексом антиген-антитело. Она широко применяется для диагностики ви­русных, микоплазменных, риккетсиозных инфекций, а также для выявления антител к возбудителям цитомегалии, токсоплаз-моза, бруцеллеза, гонореи, сифилиса. Ме­тод высокочувствителен и специфичен.

Реакция торможения гемагглютина­ции (РТГА) основана на способности некоторых вирусов (гриппа, арбовиру-сов) вызывать агглютинацию эритроци­тов. Сущностью реакции является фено­мен предотвращения (торможения) гемаг­глютинации эритроцитов вирусами под действием иммунной сыворотки.

РТГА — вспомогательный лаборатор­ный метод серодиагностики кори, красну­хи, гриппа, клещевого энцефалита, поли­омиелита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглю-тинирующими свойствами.

Диагностическую значимость сероло­гических исследований можно повысить, применяя дифференцированное опреде­ление антител, относящихся к разным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG):

IgM образуются в ранние сроки болезни и являются маркерами недавнего инфици­рования; IgG появляются в более поздние сроки заболевания, сохраняются длитель­но и обусловливают постинфекционный иммунитет.

Определение различных классов им­муноглобулинов при однократном ис­следовании крови больного проводится методом ИФА. С помощью этого метода верифицируют вирусные гепатиты, опре­деляют характер течения таких заболева­ний, как ВИЧ-инфекция, токсоплазмоз, герпетическая инфекция, цитомегалия, хламидиоз, микоплазмоз. ИФА — наибо­лее перспективный метод диагностики практически всех вирусных, бактериаль­ных и паразитарных инфекций, широко применяется в клинической практике.

Аллергигеские кожные пробы ис­пользуют с целью выявления иммуноло­гических сдвигов в организме больного. Они позволяют выявить специфическую сенсибилизацию макроорганизма при введении аллергена в кожу. Кожные ал­лергические пробы предложены для диа­гностики туберкулеза, бруцеллеза, ток-соплазмоза, туляремии, грибковых и дру­гих заболеваний. В педиатрической практике кожные пробы, кроме туберку­линовых, не нашли широкого примене­ния, что обусловлено риском развития по­бочных реакций.

Морфологигеские методы исследо­вания применяют преимущественно для установления характера и стадии патоло­гического процесса в печени при форми­ровании хронического гепатита, а также для диагностики внутриутробных инфек­ций по исследованию плаценты. Метод цитоскопии осадка мочи и слюны исполь­зуют для диагностики цитомегаловирус-ной инфекции.

Оценку данных клинико-лаборатор­ных исследований необходимо проводить с учетом особенностей течения заболева­ния в различных возрастных группах, пе­риода и формы болезни, наличия ослож-

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 559 | Нарушение авторских прав