АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Методы визуализации возбудителя.
Бактериоскопигеский метод — микроскопия окрашенных мазков исследуемого материала больного имеет ограниченное применение и является вспомогательным лишь при ряде инфекций (менингококко-вая, лептоспироз, возвратный тиф).
Еирусоскопигеский метод — обнаружение вируса при электронной микроскопии иссследуемого материала. В практике имеет ограниченное применение.
Паразитологигеский метод является основным для диагностики паразитарных заболеваний (малярия, лямблиоз, аме-биаз, криптоспоридиоз, пневмоцистоз, лейшманиоз). В основе метода — микроскопия специфически окрашенных и обогащенных мазков крови, экссудата, мокроты, кала, биоптатов органов.
Методы выявления антигенов возбудителя в сыворотке крови, секретах, выделениях или пораженных тканях используют для ранней экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и ее модификация — реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) основаны на использовании явления люминесценции при соединении антигенов бактерий,
24 -ν- общая часть
вирусов, риккетсий со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (изотиоцианатом флу-оресцеина). При прямом методе (РИФ) на взятый от больного материал, содержащий антиген (например, мазки-отпечатки со слизистой оболочки зева при ОРВИ или микоплазмозе верхних дыхательных путей), наносят специфическую люминесцирующую сыворотку, содержащую меченые антитела.
При непрямом методе (РНИФ) с целью выявления антигена мазок-отпечаток обрабатывают специфической немеченной сывороткой. Затем наносят люминесцирующую сыворотку к глобулинам немеченной сыворотки. Учет обеих реакций проводят под люминесцентным микроскопом. Метод прост, высоко чувствителен и позволяет получить ответ через несколько часов от начала исследования. РИФ и РНИФ применяют для ранней экспресс-диагностики гриппа и других ОРВИ, коклюша, микоплазменной и хла-мидийной инфекций, дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллеза, чумы, туляремии, сифилиса, токсоплазмоза, бешенства, ВИЧ-инфекции.
Радиоиммунологигеский метод (РИМ), или радиоиммунный анализ (РИА) — высокочувствительный метод, основанный на применении радиоизотопной метки антигенов или антител (часто I125). Обычно используют твердофазовый вариант РИМ, при котором антигены или антитела (в зависимости от задачи исследования) адсорбируются на твердом носителе (целлюлозе, полистироле). Сущность метода заключается в определении количества меченного радиоактивным йодом антигена после его контакта с гомологичными антителами сыворотки. Метод используют для диагностики вирусных гепатитов, бактериальных, риккетсиозных и прото-зойных заболеваний. Для выявления антигенов ВГВ к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В. Смесь
инкубируют 1—2 дня, затем добавляют к ней референс-антиген, меченный изотопом I1 и продолжают инкубацию еще 24 часа. К образовавшемуся растворимому комплексу антиген-антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белка референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата. Результат реакции учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связывающегося со специфическими антителами референс-сыворотки, последние не вступают в связь с меченным антигеном, поэтому он не обнаруживается в преципитате.
Иммуноферментный анализ (ИФА) -высокочувствителен, легко воспроизводим и не требует радиоактивных реагентов, что делает его более доступным по сравнению с РИА. Принцип метода состоит в использовании антител, конъюгиро-ванных с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой),— конъю-гатов. Присоединяясь к образовавшимся на твердой фазе иммунным комплексам, конъюгат способствует их выявлению в результате реакции фермента с хромоген-ным субстратом (ортофенилендиамином, тетраметилбензидином). В качестве твердой фазы используют различные материалы — панели для титрования, палочки и шарики, нитроцеллюлозные мембраны. Модификация с использованием мембран получила название ELISA (enzime-linked immunosorbent assay). Результаты анализа учитывают визуально и инструментально (с помощью ИФА-ридеров) по оптической плотности окрашенных продуктов реакции.
Метод широко используют для определения антигенов гепатита В в сыворотке крови, иерсиниозного антигена в кале, моче, слюне.
Полимеразная цепная реакция (ТЩР) — молекулярный метод диагностики. Сущность метода заключается в многократ-
Диагностика инфекционных болезней -Ф- 25
ном копировании целевого фрагмента ДНК ферментом ДНК-полимеразой. Дан-ный-фермент может достраивать короткий участок ДНК, называемый прайме-ром, при условии, что праймер образовал комплекс с другой цепью ДНК. Это возможно, если первичная последовательность праймера соответствует первичной последовательности целевого фрагмента (они комплементарны). Реакция проходит несколько циклов, в результате которых количество точных копий целевого фрагмента увеличивается (амплифици-руется) экспоненциально (по крайней мере в 105 раз) и многократно превышает количество всех остальных продуктов реакции.
Реакция проходит основные э т а -п ы: 1) пробоподготовка — быстрое, в течение 10 мин, выделение ДНК, готовой к амплификации (свободной от РНК, ингибиторов ДНК-полимеразы, белков) из цельной крови, тканей, суспензий клеточных культур и бактериальных клеток; 2) амплификация; 3) анализ продуктов ПЦР методом электрофореза в геле; 4) документирование результатов электрофореза.
Достоинствами метода являются высокая чувствительность и специфичность, быстрота постановки. С помощью ПЦР можно верифицировать вирусные гепатиты, диагностировать хламидиоз, мико-плазмоз, герпетическую инфекцию, корь, краснуху, инфекционный мононуклеоз, дифтерию, ВИЧ-инфекцию и др.
Методы обнаружения специфиге-ских антител. Методы серологической диагностики (обнаружение антител в сыворотке крови) широко распространены. Однако они являются методами поздней и ретроспективной диагностики. Для большинства серологических методов необходимо исследование парных сывороток в динамике заболевания с интервалом 7—14 дней.
Оценка результатов серологического исследования в ряде случаев затруднена.
В частности, иммунологический ответ может быть недостаточно напряженным на фоне первичного или вторичного иммунодефицита, а также у детей раннего возраста, особенно недоношенных. Кроме того, у детей раннего возраста могут определяться материнские антитела, у привитых — поствакцинальные.
Необходимо также учитывать, что серологические реакции не являются абсолютно специфичными ввиду наличия общих антигенов у возбудителей, относящихся к одному и даже разным видам. Специфичность серологических тестов зависит также от качества применяемых диагностикумов, правильности получения, обработки и хранения исследуемых сывороток. Так, например, нельзя использовать для исследования сыворотки, имеющие признаки бактериального загрязнения, гемолиза, посторонние примеси, многократно замораживаемые и оттаиваемые, длительно хранящиеся при комнатной температуре.
Для серологической диагностики инфекционных заболеваний широко используют РА, РЛА, ΡΗΓΑ, РСК и РТГА. Эти реакции чаще используют для обнаружения антител, но их можно применять и с целью выявления антигенов.
Реакцию агглютинации (РА) используют для определения специфических антител с помощью известного антигена, а также с целью установления вида микроба с помощью известных антител. Она широко используется для диагностики брюшного тифа (брюшнотифозный Видаль), стафилококковой инфекции (стафилококковый Видаль), иерсиниоза, бруцеллеза (реакция Райта, реакция Хеддлсона).
Модификация РА, при которой на носитель (частица латекса) наносят очищенные антигены, называется реакцией латексной агглютинации (РЛА). В настоящее время она применяется для диагностики дифтерии, коклюша, ВИЧ-инфекции, менингококковой, гемофильной, пневмококковой и кишечных инфекций.
26 -Φ" ОБЩАЯ ЧАСТЬ
Реакция непрямой гемагглютинации (ΡΗΓΑ) по чувствительности превышает реакцию агглютинации. Это достигается использованием эритроцитов, на поверхности которых сорбируются антигены (бактериальные и вирусные) или антитела. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенными эритроцитарными диагностикумами и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами, именуют иммуноглобу-линовыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.
ΡΗΓΑ широко используется для диагностики острых кишечных инфекций, коклюша, ОРВИ, дифтерии, боррелиоза и др.
Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген-антитело. Она широко применяется для диагностики вирусных, микоплазменных, риккетсиозных инфекций, а также для выявления антител к возбудителям цитомегалии, токсоплаз-моза, бруцеллеза, гонореи, сифилиса. Метод высокочувствителен и специфичен.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на способности некоторых вирусов (гриппа, арбовиру-сов) вызывать агглютинацию эритроцитов. Сущностью реакции является феномен предотвращения (торможения) гемагглютинации эритроцитов вирусами под действием иммунной сыворотки.
РТГА — вспомогательный лабораторный метод серодиагностики кори, краснухи, гриппа, клещевого энцефалита, полиомиелита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглю-тинирующими свойствами.
Диагностическую значимость серологических исследований можно повысить, применяя дифференцированное определение антител, относящихся к разным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG):
IgM образуются в ранние сроки болезни и являются маркерами недавнего инфицирования; IgG появляются в более поздние сроки заболевания, сохраняются длительно и обусловливают постинфекционный иммунитет.
Определение различных классов иммуноглобулинов при однократном исследовании крови больного проводится методом ИФА. С помощью этого метода верифицируют вирусные гепатиты, определяют характер течения таких заболеваний, как ВИЧ-инфекция, токсоплазмоз, герпетическая инфекция, цитомегалия, хламидиоз, микоплазмоз. ИФА — наиболее перспективный метод диагностики практически всех вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций, широко применяется в клинической практике.
Аллергигеские кожные пробы используют с целью выявления иммунологических сдвигов в организме больного. Они позволяют выявить специфическую сенсибилизацию макроорганизма при введении аллергена в кожу. Кожные аллергические пробы предложены для диагностики туберкулеза, бруцеллеза, ток-соплазмоза, туляремии, грибковых и других заболеваний. В педиатрической практике кожные пробы, кроме туберкулиновых, не нашли широкого применения, что обусловлено риском развития побочных реакций.
Морфологигеские методы исследования применяют преимущественно для установления характера и стадии патологического процесса в печени при формировании хронического гепатита, а также для диагностики внутриутробных инфекций по исследованию плаценты. Метод цитоскопии осадка мочи и слюны используют для диагностики цитомегаловирус-ной инфекции.
Оценку данных клинико-лабораторных исследований необходимо проводить с учетом особенностей течения заболевания в различных возрастных группах, периода и формы болезни, наличия ослож-
Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 606 | Нарушение авторских прав
|