АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Гнойно-воспалительных болезней

Граница между патогенными и непатогенными микроорганизмами четко не обозначена. Помимо микроорганизмов, которые практически всегда при минимальных инфицирующих дозах вызывают у человека инфекционное заболевание, и микроорганизмов, которые даже при больших инфицирующих дозах не вызывают болезни человека, существует множество микроорганизмов, занимающих промежуточное положение. Такие микроорганизмы нередко высевают при обследовании совершенно здорового человека, не предъявляющего жалоб на здоровье, и эти же микроорганизмы могут вызывать тяжелейшее заболевание человека, нередко со смертельным исходом. Такие микроорганизмы называют условно-патогенными или микробами-оппортунистами (от англ. to take opportunity - воспользоваться благоприятной возможностью).

Многими учеными делались попытки провести четкие грани между патогенными, условно-патогенными, микробами-оппортунистами и непатогенными микроорганизмами, но эти грани настолько размыты и настолько важную роль играет состояние микроорганизма в возникновении инфекции, что на уровне современных знаний это вряд ли возможно.

В настоящее время в мировой литературе появился термин «клиническая микробиология», которая изучает инфекционные процессы, вызванные условно-патогенными микроорганизмами в неинфекционных стационарах. Возбудителями таких гнойно-воспалительных заболеваний человека могут быть представители нормальной микрофлоры человеческого тела и микроорганизмы, обитающие в окружающей среде, обладающие слабой патогенностью для человека: все стафилококки, многие стрептококки, некоторые нейесерии, эшерихии, клебсиеллы, протеи, энтеробактеры, цитобактеры, псевдомонады, бактероиды, грибы и другие. Эти слабопатогенные микроорганизмы могут вызвать гнойно-воспалительные заболевания в тех случаях, когда их концентрация очень велика, а естественная сопротивляемость макроорганизма резко снижена. Люди со сниженной резистентностью называются иммунокомпромиссными хозяевами. Это состояние может быть вызвано длительным заболеванием (хронические пневмония, пиелонефрит и др.), обширным хирургическим вмешательством, онкологическими болезнями, врожденными иммунодефицитами. Необоснованное назначение гормональных препаратов, антибиотиков может вызывать иммунодепрессивное состояние, не говоря о тех случаях, когда врач вынужден угнетать иммуногенез для предотвращения отторжения трансплантата (например, пересадка ночки) или в других случаях.

Большое количество иммунокомпромиссных хозяев находится в различных стационарах: хирургические отделения, ожоговые центры, отделения реанимации и интенсивной терапии, отделения недоношенных детей и т. п. Поэтому оппортунистические инфекции обычно носят характер госпитальных инфекций. Оппортунистические инфекции представляют собой серьезную проблему современной клинической медицины во всем мире.

Немало способствуют распространению госпитальных инфекций антисанитарные условия пребывания больных в стационарах, погрешности медицинских работников в асептике и антисептике. Часто медицинский инструментарий и аппаратура не подвергаются достаточной дезинфекции и стерилизации, иногда условно-патогенные бактерии можно обнаружить даже на перевязочном и шовном материале, в готовых лекарственных формах.

В некоторых случаях условно-патогенные микроорганизмы контаминируют (заселяют) больничную аппаратуру, служащую для обследования и лечения больных, или аптечные приборы, используемые для приготовления лекарственных форм.

Диагностика оппортунистических инфекций связана со многими трудностями из-за многообразия локализации воспалительных процессов и, следовательно, симптоматики заболеваний. Кроме того, обнаружение в гное или мокроте стафилококка не является доказательством того, что стафилококк вызвал это заболевание, так как стафилококк (как и большинство других условно-патогенных микроорганизмов) является представителем нормальной микрофлоры человеческого тела. Для доказательства этиологической значимости выделенных микробов-оппортунистов необходимы количественные исследования, доказывающие высокую концентрацию данного микроорганизма в исследуемом субстрате. Другим доказательством этиологической значимости выделенной культуры может служить положительная сероконверсия: нарастание титров антител к данному микроорганизму при наблюдении за больным в течение 2-3 нед.

Большинство клинических микробиологических лабораторий и лабораторий санитарно-эпидемиологических станций мало используют технику анаэробных посевов, поэтому редко обнаруживают в исследуемом материале облигатных анаэробных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний. Одни из наиболее распространенных нормальных обитателей кишечника человека бактерии рода Bacteroides нередко в сочетании с другими микробами-оппортунистами вызывают локальные абсцессы брюшной полости, полости малого таза, челюстно-лицевой области и др.

Условно-патогенные бактерии могут быть обнаружены не только в патологическом материале, взятом от больного, но и в смывах с предметов окружающей среды: халатов, рук персонала больницы или аптеки, инструментов, посуды, лабораторной аппаратуры, перевязочного и шовного материала, готовых лекарственных форм. Выделенные чистые культуры идентифицируются до вида.

Кокки. В эту группу входят патогенные и условно-патогенные для человека круглые формы бактерий. Среди них есть строгие анаэробы (пептококки, пептострептококки, вейлонеллы), факультативные анаэробы и аэробы (стафилококки, стрептококки, нейссерии). Все они могут вызывать у человека гнойно-воспалительные заболевания, различающиеся по локализации и тяжести.

Стафилококки. Отдел Firmlcutes, семейство Micrococcaceae, род Staphylococcus,, В род Staphylococcus по классификации Байрд-Паркер входят 3 вида: S. aureus, S. epidermldis и S. saprophyticus. Все виды стафилококков представляют собой округлые клетки диаметром 0,5-1 мкм. В мазке располагаются обычно несимметричными гроздьями («гроздья винограда»), но встречаются одиночные клетки, пары клеток. Грамположительны. Спор не образуют, жгутиков не имеют, У некоторых штаммов можно обнаружить капсулу. Могут образовывать L-формы. Клеточная стенка содержит большое количество пептидогликана, связанных с ним тейхоевых кислот, протеин А.

Стафилококки хорошо растут на простых средах (рН 7-7,5), факультативные анаэробы. На плотных средах образуют гладкие, круглые выпуклые колонии с различным пигментом. Пигмент не имеет таксономического значения. Могут расти на агаре с высоким содержанием (8-10%) NaCL Обладают сахаролитическими и протеолитическими ферментами. Стафилококки вырабатывают гемолизины, фибринолизин, фосфатазу, р-лактамазу, бактериоцинины, энтеротоксины, коагулазу, ДНКазу, лейкоцидины, лецито-вителлазу и др.

Стафилококки очень пластичны: быстро вырабатывают устойчивость к антибактериальным препаратам. Существенную роль в этом играют плазмиды, передающиеся с помощью транедуцирующих фагов от одной клетки к другой. R-плазмиды детерминируют устойчивость к одному или нескольким антибиотикам, в том числе и за счет зкстрацеллюлярной продукции β-лактамазы - фермента, разрушающего пенициллин, разрывающего его β -лактамное кольцо.

При микробиологической диагностике отнесение культуры к роду стафилококков основывается на типичной морфологии и окраске клеток, их взаимном расположении и анаэробной ферментации глюкозы. Для видовой идентификации используют в основном 3-4 теста: продукцию плазмокоагулазы, лецитовителлазы, анаэробную ферментацию маннита и глюкозы. В сомнительных случаях проводят тесты на наличие ДНКазы, ά-токсина.

Возбудителем стафилококковых инфекций чаще является S. aureus, несколько реже - S. epldemiidis, очень редко - S. saprophytlcus. Стафилококки являются представителями нормальной микрофлоры человеческого тела, поэтому микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций не может ограничиться выделением и идентификацией возбудителей; необходимы количественные методы исследования, т. е. определение числа микроорганизмов в пробе.

Лечение стафилококковых инфекций обычно проводится антибиотиками и сульфаниламидными препаратами. В последние годы от больных часто выделяются стафилококки, резистентные к большинству химиотерапевтических препаратов. В таких случаях для лечения используют антитоксическую противостафилококковую плазму или иммуноглобулин, полученные из крови доноров, иммунизированных стафилококковым анатоксином. Для активной иммунизации (плановых хирургических больных, беременных женщин) может быть использован адсорбированный стафилококковый анатоксин.

Хламидии. Возбудитель трахомы

Трахома (от греч. trachys - неровный, шероховатый) - хроническое инфекционное заболевание глаз, вызываемое Chlamydia trachomatis, характеризующееся поражением роговицы и конъюнктивы с образованием фолликулов (трахоматозных зерен), изъязвление которых приводит к рубцеванию.

Возбудитель трахомыМС. trachomatis, открытый в 1907 г. С. Провачеком и Л. Хальберштедтером, относится к семейству Chlamydlaceae, отделу Graeffieutes.

Возбудитель трахомы - грамотрицательная мелкая бактерия; внутриклеточный облигатный паразит. Размножаясь в клетках эпителия роговицы глаза, образует включения - тельца Провачека, окрашивающиеся по Романовскому-Гимзе в фиолетово-синий цвет с красными зернышками.

Культивируется в куриных эмбрионах, культурах клеток конъюнктивы глаза. Возбудитель относительно нестоек, инактивируется при действии физических и химических факторов.

Tpaxoма известна давно; заболевание распространено повсеместно, имеются эндемические очаги; в настоящее время заболевание, носит спорадический характер. Болеют только люди. Источником инфекции являются больные и носители. Заражение происходит контактно-бытовым (прямым или косвенным) путем - через руки, предметы обихода (полотенца, одежду и др.). Заболевание связано с повреждающим действием хламидий на эпителиальные клетки конъюнктивы и роговицы с последующим распространением процесса на лежащие более глубоко ткани. Инкубационный период составляет 7-14 дней. Поражаются обычно оба глаза. Начало заболевания незаметное или острое; ощущение инородного тела и чувство жжения в глазах. Возможно и острое начало: светобоязнь, слизисто-гнойное отделяемое. Развиваются конъюнктивит и кератоконъюнктивит, сопровождающиеся изъязвлением и рубцеванием, что может привести к образованию бельма и слепоте.

'Возбудитель обнаруживается в цитоплазме клеток эпителия конъюнктивы в форме включений - телец Провачека. Выделяют возбудителя из со-скобов конъюнктивы путем заражения куриного эмбриона. Используют РИФ для обнаружения возбудителя в соскобах конъюнктивы или антител в сыворотке больного.

Для лечения наиболее эффективны тетрациклины в виде мазей, рифампицин и сульфаниламиды. Специфическая профилактика отсутствует. Неспецифическая профилактика заключается в проведении просветительной работы, контроле за соблюдением гигиенических требований - в семейных очагах.

Возбудитель венерической гранулемы

Венерическая гранулема (донованоз, пятая венерическая болезнь, тропическая паховая гранулема) - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая Calymmatobacterium granulomaris, характеризующаяся наличием на коже половых органов узелков, пузырьков, эрозий иди язв. Заболевание протекает обычно длительно-1-2 года. Прогноз благоприятный.

Возбудитель - короткая, неподвижная грамотрицательная палочка, споры и капсулы не образует. Патогенна только для человека. Заражение происходит главным образом половым путем, реже - бытовым. Патогенез не изучен. Заболевание не оставляет иммунитета, возможны реинфекция и суперинфекция. Наблюдается преимущественно в тропических, реже в субтропических странах.

Микробиологический диагноз основывается на обнаружении возбудителя в кусочке ткани, взятом из очага поражения, и постановке внутрикожной реакции с инактивированной культурой возбудителя.

Лечение проводят антибиотиками широкого спектра действия и сульфаниламидами. Профилактика заключается в выявлении и лечении больных. Специфической профилактики нет.

Основная литература

1. Донецкая Э.Г. Клиническая микроибиология. М., Геотар-Медиа, 2011. 408 с.

2. Сидоренко О.Д. Борисенко Е.Г., Ванакова А.А. Микробиология. М., ИНФРА, 2010. 287 с.

3. Микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. Царева В.Н. Практическая медицина. М., Геотар Медиа, 2010.

4. Медицинская микробиология: Учебное пособие / Гл. ред. В.И. Покровский, О.К. Поздеев.- М.: ГЭОТАР-Медицина, 2010. 1200 с.

5. Воробьев А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология. М., Академия, 2010.

6. Воробьев А.А., Быков А.С., Пашков Е.П. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., Медицина, 2008. 700 с.

7. Лабинская А.С., Костюкова Н.Н., Иванова С.Н. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и эпидемиологическая диагностика инфекций. Кн.2. М., 2010. 1152 с.

8. Лабинская А.С., Волоина Е.Г. Руководство по медицинской микробиологии. Общая санитарная микробиология. М., «Бином», 2008.

9. Лабинская А.С., Блинкова Л.П., Ещина А.С. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований. М., Медицина, 2005.

10. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология. М., Академия, 2009.

11. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии. М., Академия, 2009. 603 с.

12. Сбойчаков В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований. СПб., 2011.

13. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: Учебник для студентов вузов / Л.Б. Борисов. – 4-е изд., доп. и перераб. – М., Мед. информ. агентство, 2005. – 736 с.: илл.

14. Борисов Л.Б. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учеб. Пособие для студ. мед. вузов / Л.Б. Борисов, Б.Н. Б.Н. Козьмин-Соколов, И.С. Фрейдлин. – М.: Медицина, 1993. – 240 с.

15. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для студентов медицинских вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев; ред. А.И. Коротяев. - 2-е изд., испр. – СПб.: Спец. лит, 2000.-592 с.

16. Хаитов Р.М. Иммунология [Электронный ресурс]: учебник для вузов с компакт-диском/ Р.М. Хаитов. – М.: ГОЭТАР-Медиа, 2006. – 320 с.

17. Степанова Э.А. Общая микробиология: Метод.рек.для практ.занятий / Э. А. Степанова, Г. С. Архипов; Новгород.гос.ун-т им.Ярослава Мудрого. - Великий Новгород, 2001. - 51с. -

18. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л. Б. Борисов. - 2-е изд.,доп.и перераб. - М.: Медицинское информ.агентство, 2002. - 734с.,

19. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология,вирусология,иммунология: Учеб.для студентов вузов / Л. Б. Борисов. - 3-е изд.,стер. - М.: Медицинское информ.агентство, 2002. - 734с.

20. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учеб.для мед.вузов / А. И. Коротяев, С. А. Бабичев; Под ред.А.И.Коротяева. - 3-е изд., испр.и доп. - СПб.: СпецЛит, 2002. - 580,[12]с.

21. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учеб.пособие / А. А. Воробьев [и др.]; Под ред.:А.А.Воробьева, А.С.Быкова. - М.: Медицинское информ.агентство, 2008. - 232с.

Дополнительная литература

1. Вопросы вирусологии: Двухмесячный научно-теоретический журнал – М.: Изд. «Медицина», 2002-2008.

2. Журнал микробиология, эпидемиология и иммунобиология: Двухмесячный научно-практический журнал – М.: Изд «С-ИНФО», 2002-2008

3. Спирохетозы: Метод.рекомендации / Авт.-ост.:Т.Л.Могилевец, Е.И.Архипова, И.И.Москвин; Новгород.гос.ун-т им.Ярослава Мудрого. - Великий Новгород, 2005. - 39с.

Лабораторный практикум

ТЕМА: Морфология микроорганизмов

Работа 1. Морфология бактерий

Бактерии по форме делятся на несколько групп: сферические, цилиндрические, спиральные, необычной формы и нитчатые.

Сферические бактерии, или кокки (гр. kokkos - ягода, зерно), имеют округлую форму. В зависимости от расположения клеток после их деления подразделяются на группы:

Микро- (или моно-) кокки

Диплококки

Стрептококки

Тетракокки

Сарцины

Стафилококки

Кроме круглой формы кокки могут быть ланцетовидными, овальными, удлиненными, чечевицеобразными и др. Большинство кокков неподвижны и не образуют эндоспор.

Цилиндрическая форма (гр. Bacteria - палочка, лат. Bacillum - палочка) характерна для большинства бактерий. Палочковидные бактерии подразделяются на образующие и не образующие эндоспоры.

Палочки, образующие споры, называют бациллами. Спорообразование у бактерий - способ перенесения неблагоприятных внешних воздействий. В клетке образуется только одна спора. Различают три вида спорообразования:

Бациллярный

Клостридиальный

Плектридиальный

Среди палочковидных бактерий есть подвижные и неподвижные формы. Подвижные имеют жгутики:

Перитрих

Лофотрих

Амфитрих

Монотрих

Спиральной формы бактерии различаются количеством и характером завитков, длиной и толщиной клеток. Их можно разделить на не гнущиеся (вибрионы – изгиб не превышает ¼ оборота спирали, спириллы – имеют один или несколько правильных витков) и изгибающиеся (спирохеты – имеют много витков, напоминают штопор).

Необычные формы бактерий морфологически разнообразны: тороидальные, звездообразные, канатоподобные, тубероидальные, червеобразные и др.

Нитчатые формы бактерий - это в большинстве случаев палочковидные клетки, которые соединяются в длинные цепочки, объединяемые слизью, чехлами или общей оболочкой.

Морфология плесневых грибов

Под названием «плесневые грибы» объединяют представителей различных классов грибов. Вегетативное тело грибов организовано в виде мицелия. На плотных средах плесени образуют пушистый паутинообразный налет различной окраски. Воздушный мицелий состоит преимущественно из спороносной части гриба, вегетативное тело проникает в субстрат. Плесени размножаются спорами и участками мицелия. Мицелий Фикомицетов (Mucor, Rhizopus) несегментированный, на отдельных его веточках образуются спорангиеносцы с шаровидными спорангиями, наполненными эндоспорами. Мицелий Аскомицетов (Pencillium, Aspergillus) септирован, они образуют преимущественно конидиальные спороношения.

Строение колоний и мицелия, его ветвление, строение и расположение спороносцев можно изучать, просматривая колонии актиномииетов и грибов, выросшие на плотной питательной среде в чашках Петри при малом увеличении микроскопа.

Морфология актиномицетов

Общим признаком актиномицетов, или ветвящихся бактерий, является способность образовывать при развитии в питательной среде мицелий толщиной 0.6-1.4 мкм. У одних актиномицетов мицелий хорошо развит, у других способность к его образованию выражена лишь в тенденции клеток к ветвлению и проявляется в строго определенных условиях. По строению клетки и ее химическому составу актиномицеты во многом напоминают бактерии, а по способности образовывать мицелий и строению органов плодоношения – грибы.

Колонии актиномицетов представляют собой сложную систему несегментированных гиф, часть которых при росте на агаризованной среде проникают в субстрат – субстратный мицелий, а другая часть свободно ветвится в воздухе и образует на поверхности колонии пушистый, бархатистый или мучнистый налет, состоящий из воздушного мицелия.

Размножаются актиномицеты обрывками мицелия или спорами, образующимися бесполым путем и располагающимися одиночно, парами, цепочками или в спорангиях.

Культуры стрептомицетов, выращенные на питательной среде в чашках Петри, изучают непосредственно на чашке при малом увеличении (объектив 10х), помещая открытую чашку на предметный столик микроскопа. При этом можно видеть, что гифы мицелия частично внедряются в субстрат, частично стелются по поверхности и приподнимаются над ней. Просматриваются спорофоры со спорами. Из этих же культур готовят препараты для микроскопического изучения: на предметное стекло наносят каплю 10% раствора щелочи (КОН или NаОН) или 70-90% раствор уксусной кислоты или 60% этанола, в которой расщепляют с помощью двух препаровальных игл мицелий, взятый с небольшим кусочком подлежащей питательной среды. Препарат плотно накрывают покровным стеклом и микроскопируют с объективом 40х. На таком препарате хорошо видна разница в толщине субстратных и воздушных гиф, форма спороносцев. Для изучения типа спорообразования, формы и размера спор готовят препарат «отпечаток». Для приготовления такого препарата покровное стекло плотно прижимают к поверхности колонии, а затем покровное стекло помещают на предметное стекло в каплю воды отпечатком вниз; микроскопируют с объективом 40х.

Морфология дрожжей

Термин «дрожжи» не имеет таксономического значения. К дрожжам относят все грибы, которые вегетативно размножаются в одноклеточной форме независимо от того, имеют или не имеют они мицелиальную фазу.

Наиболее обычным способом вегетативного размножения является почкование. Дрожжам свойственен и половой процесс. Образование спор у дрожжей – одновременно и процесс формирования устойчивых к неблагоприятным воздействиям форм.

Дрожжевая клетка может иметь круглую, овальную, лимоновидную, бутылевидную, треугольную или серповидную форму. Размеры клеток от 2-3 мкм до 25-50 мкм в длину, ширина не превышает 10 мкм. Некоторые почвенные дрожжи (Lipomyces, Cryptococcus) способны образовывать капсулы.

Наблюдение за строением и размножением дрожжевых клеток с помощью микроскопа проводят на живых культурах, приготавливая нативные и окрашенные препараты «раздавленной» и «висячей капли».

Прижизненная окраска цитоплазмы дрожжей, выявление живых и мертвых клеток

К суспензии дрожжей на предметном стекле добавляют каплю раствора метиленового синего (1:100), накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Подобным образом дифференцируют живые и мертвые клетки дрожжей. Мертвые клетки окрашиваются быстрее и ярче за счет повышения проницаемости клеточной оболочки. Живые клетки, не пропускающие краситель, не окрашены.

Для определения формы бактерий, способности их к спорообразованию, подвижности достаточно исследовать их в живом состоянии на препаратах «раздавленная капля», «висячая капля» и «отпечаток».

Задание.

Познакомиться с формой клеток конкретных штаммов кокковидных бактерий, приготовив фиксированные препараты, промикроскопировать (100х, МИ), зарисовать. Познакомиться в формой клеток палочковидных бактерий (фиксированные препараты, 100х, МИ), зарисовать. Познакомиться с формой клеток извитых бактерий на примере культуры Rhodospirillum rubrum и спирохет, выявляемых в фиксированном окрашенном препарате из зубного налета (100х, МИ). Познакомиться с формой клеток нитевидных цианобактерий (препарат «висячая капля», 40х), зарисовать. Конкретные культуры для приготовления препаратов предлагаются на занятии. Приготовить и рассмотреть окрашенный метиленовой синью препарат дрожжей. Найти мертвые, живые, почкующиеся клетки. Зарисовать сделать необходимые обозначения.

Материал и оборудование: микроскоп биологический, предметные стекла, покровные стекла, бактериальная петля, красители, капельница с водой, чашки Петри с колониями бактерий.

Работа 2. Приготовление фиксированных препаратов и препаратов

живых клеток

Препарат «раздавленная капля». На чистое предметное стекло наносится небольшая капля водопроводной воды; дистиллированную воду брать не рекомендуется, так как в ней отсутствуют необходимая для микробов концентрация солей, что может вызвать изменение формы клеток, потерю ими подвижности и т.д. В каплю воды бактериологической петлей, прокаленной в пламене горелки и охлажденной, помещают исследуемый материал. Если исследуют негустые суспензии микробных клеток, то каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Препарат накрывают покровным стеклом, помещают на предметный столик микроскопа и исследуют в сухой системе. Не следует вносить много культуры, препарат будет густым и мало пригодным для наблюдения; нельзя допускать образования пузырьков воздуха под покровным стеклом. Капля с исследуемым материалом должна быть такой, чтобы после прижимания ее покровным стеклом жидкость не выступала из-под стекла. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой.

В препарате можно найти микро-, дипло-, стрептококки, бактерии, бациллы. По характеру их движения можно предположить тип жгутикования (сами жгутики в живом препарате увидеть не удается): перитрих – кувыркающиеся движения, монотрих, лофотрих – направленное, стремительное. Споры в водном препарате отличаются от микрококков резкой очерченностью, сильно преломляют свет и кажутся блестящими или темными.

Препарат «раздавленная капля» быстро готовится, и позволяет установить форму клеток микроорганизмов, их размеры, способ спорообразования а также наличие или отсутствие подвижности, но, к сожалению, является недолговечным.

Препарат «висячая капля» используют для наблюдения за размножением микроорганизмов, образованием и прорастанием спор, для выявления подвижности и отношения клеток к химическим раздражителям.

Каплю суспензии микроорганизмов петлей наносят на покровное стекло, которое переворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что допускает многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят в жидкой питательной среде.

Препарат «отпечаток» используют для изучения естественного расположения клеток в колонии микроорганизмов и чаще всего для исследования формы спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов.

Из агаризованной среды, на которой исследуемые микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей пли пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом.

Задание.

Приготовить препарат «раздавленная капля» настоя гороха или картофеля и изучить формы бактерий. Обратить внимание на характер спорообразования, движения палочковидных форм. Сделать зарисовки в тетради.

Просмотреть колонии актиномицетов или плесневых грибов, выращенных на плотной питательной среде в чашках Петри, при малом увеличении микроскопа, а также приготовить препараты «отпечатки» и изучить строение мицелия и споронсцев со спорами. Зарисовать и обозначить их.

Материалы и оборудование: коллекция культур, биологический микроскоп, предметные и покровные стекла, бактериологические петли (иглы), препаровальные иглы, свежий 5%-ный раствор фуксина.

Работа 3. Фиксированные препараты микроорганизмов и их окраска

Приготовление препаратов фиксированных клеток. Фиксированные окрашенные препараты используют для выявления ряда морфологических особенностей, количественного учета микроорганизмов, а также для проверки чистоты культуры. Эти препараты удобны тем, что могут храниться длительное время, имеют высокую контрастность, позволяют дифференцированно выявлять клеточные структуры, кроме того, работа с ними безопасна. Фиксированные окрашенные препараты рассматривают с иммерсией. Их приготовление включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску препарата.

Приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло наносят исследуемый материал и равномерно распределяют его петлей или краем покровного стекла на площади 1-2 см² возможно более тонким слоем.

Высушивание мазка. Препарат сушат при комнатной температуре на воздухе. Тонкий мазок, высыхает очень быстро. Если высушивание мазка замедлено, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем горелки мазком вверх. Эту операцию проводят очень осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация преследует несколько целей: обеспечить прикрепление клеток к стеклу и тем самым предохранить препарат от смывания; сделать мазок более восприимчивым к окраске, поскольку мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые; сделать безопасным дальнейшее обращение с мазком, что особенно важно, если клетки исследуемого микроорганизма являются патогенными. Фиксацию клеток осуществляют различными веществами и высокой температурой. Весьма распространенный способ фиксации - термическая обработка. Препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом могут произойти грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание. После фиксации клетки микроорганизмов окрашивают.

Окраска микроорганизмов – сложный физико-химический процесс, в котором играют роль явления электроадсорбции, капиллярности, химического сродства между красителем и объектом. Некоторые красители характеризуются избирательным сродством к отдельным компонентам клетки (ядерному веществу, включениям) и применяются для их выделения.

Для окрашивания микроорганизмов применяют специальные бактериологические красители, которые являются производными анилина (анилиновые красители) и добываются из каменноугольной смолы По химическим свойства анилиновые красители подразделяются на кислые (протоплазматические), основные (ядерные).

При исследовании микроорганизмов применяют почти исключительно основные красители, так как бактерии в отношении красителей ведут себя так, как если бы они состояли в основном из нуклеиновой кислоты, которая легко реагирует с основными красителями, что приводит к окрашиванию клетки.

Из основных красителей наиболее часто употребляют: фуксин, сафранин (красные), нейтральрот, генцианвиолет, метилвиолет, кристаллвиолет, метиленовую синьку, малахитовую и бриллиантовую зелень, а из кислых – кислый фуксин, конго, эозин, нигрозин, эритрозин, ауранцию и пикриновую кислоту. Красители интенсивно связываются с цитоплазматическими (основными) компонентами клетки. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы.

Пользуясь комбинацией кислых и основных красок, можно произвести дифференциацию структурных частей клетки (ядра, протоплазмы и т.д.).

Фиксированный препарат помещают на препаротодержатель и покрывают раствором какого-либо красителя. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на фильтровальную бумагу, покрывающую препарат. Следят, чтобы во время окрашивания раствор красителя на мазке не подсыхал. Через 1-3 мин мазок промывают слабой струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Препарат осторожно промокают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом.

При простых методах окраски используют один краситель, при этом прокрашивается вся клетка и хорошо видны ее формы и размеры. Сложные методы заключаются в последовательном окрашивании двумя или несколькими красителями, при этом прокрашивается не вся клетка, а лишь определенные ее структуры, например ядерный аппарат. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными оказываются только клетки микроорганизмов или их структуры.

Задание.

Приготовить фиксированные препараты микроорганизмов, окрасить препараты простым методом.

Материалы и оборудование: биологический микроскоп, предметные стекла; бактериологическая петля, кристаллизатор; капельница с водой, красители, иммерсионное масло, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага; дезинфицирующий раствор.

Работа 4. Окраска клеток микрооганизмов по Грамму

Впервые метод окраски микроорганизмов предложен в 1884 г. датским ученым Х.Грамом для выявления бактерий в гистологических срезах.

Сущность метода заключается в том, что при обработке красителями генцианвиолета и кристалвиолета с йодом в клетках одних микроорганизмов образуется относительно устойчивый и нерастворимый комплекс, который удерживается ими при обработке спиртом. Эти микроорганизмы относят к грамположительным, они остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом, и их выявляют, дополнительно окрашивая контрастной краской (водным фуксином). В основе механизма окраски по Граму лежат особенности химического состава и строения клеточных стенок бактерий.

У грамположительных бактерий пептидокликан однослоен, имеется наружная мембрана, в состав которой входят фосфолипиды, липопротеиды, белки и сложный липополисахарид (ЛПС). Всю наружную мембрану пронизывают белки-порины, обеспечивающие диффузию различных соединений. Таким образом, у грамположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.

Окраска по Граму имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза и др., к грамотрицательным гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий могут окрашиваться по Граму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по Граму, состоит в «переобесцвечивании» мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.

Для окраски берут клетки молодых 18-24 ч. культур бактерий, так как с возрастом в бактериальной популяции увеличивается количество мертвых клеток, которые всегда грамотрицательные, а некоторые грамположительные бактерии становятся грамотрицательными (например, Lactobacillus).

Окраску по Граму проводят следующим образом:

1. Готовят мазок культуры исследуемого микроорганизма на предметном стекле, который высушивают на воздухе, фиксируют жаром.

2. На препарат помещают фильтровальную бумагу и наносят раствор генцианвиолета. Экспозиция 2 мин.

3. Не смывая краски, добавляют раствор Люголя (I в KI) на 2 мин. (до почернения мазка).

4. Сливают растворы красок и препарат обесцвечивают 96° этиловым спиртом в течение 60 сек.

5. Препарат быстро, чтобы не увеличить экспозицию спирта, промывают водой.

6. Дополнительно контрастно окрашивают водным раствором основного фуксина. Экспозиция 2 мин.

7. Препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

В поле зрения микроскопа грамположительные бактерии сине-фиолетового цвета, грамотрицательные – красные.

Определение принадлежности бактерий к грамположительным или грамотрицательным можно проводить с помощью экспресс-анализа с 3% КОН. Для этого на предметное стекло помещают каплю раствора щелочи, в которую вносят бактериологической петлей исследуемую культуру и перемешивают в течение 60 сек. Если суспензия микроорганизмов в щелочи становиться вязкой или желеобразной, то культура относится к грамотрицательным, в противном случае - к грамположительным.

Задание

Приготовить фиксированный препарат, окрасить его по методу Грама, промикроскопировать при увеличении объектива 40х. Дополнительно провести экспресс-анализ с 3% КОН. Результаты наблюдения занести в тетрадь.

Препараты, работа с которыми закончена, прежде чем вымыть выдерживают в дезинфицирующем растворе.

Материалы и оборудование: красители и реактивы по Грамму, предметные стекла, бактериологические петли, спирт с эфиром (1:1), иммерсионное масло, хлопчатобумажные салфетки, фильтровальная бумага.

ТЕМА: ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Работа 5. Питательные среды. Принципы их составления

Для накопления, выделения, культивирования и сохранения микроорганизмов пользуются питательными средами, которые не только содержат питательные вещества, но и являются средой обитания микроорганизмов. Поэтому при составлении сред учитывают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для их жизни, так и физико-химические условия, в которых микроорганизмы могут осуществлять обмен между клеткой и средой.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Вопросы стандартизации питательных сред тесно связаны с совершенствованием методов их контроля. Качество питательных сред контролируют по совокупности физико-химических, биологических показателей.

Решающим и наиболее сложным в оценке качества питательных сред и их ингредиентов является бактериологический контроль. Для применяемых в производстве сред главным интегральным свойством качества служит их эффективность (урожайность), т.е. способность обеспечить накопление максимального количества биомассы полноценных по свойствам микроорганизмов или продуктов их биосинтеза (токсинов и др.).

В оценке дифференциально-диагностических и элективных ведущим критерием является такой показатель, как чувствительность - способность обеспечить рост микроорганизмов в минимальных дозах. Немаловажными критериями оценки качества этих сред являются скорость роста, стабильность основных биологических свойств микроорганизмов, выраженность дифференцирующих свойств и показатель ингибиции посторонней микрофлоры.

Требования, предъявляемые к питательным средам

• Среды должны содержать все необходимые для микроорганизмов источники питания. Недостаток или избыток питательных элементов неблагоприятны для роста микроорганизмов. Специфичность питательных сред определяется набором соединений, поставляющих клеткам углерод и азот. Минеральный фон сред для многих микроорганизмов бывает очень близок по составу, так как микроорганизмы по потребностям в минеральных веществах менее разнообразны. По мере необходимости в среды добавляют факторы роста (витамины, гормоны) в незначительных концентрациях.

• Среды должны содержать отдельные ингредиенты в определенных соотношениях, примерно соответствующих соотношению их в клетке. Для

большинства гетеротрофов применяют среды, содержащие 0.8-1.2 г/л аминного азота (в составе NH₂), 2.5-3.0 г/л общего азота, 1% пептона и 0.5% хлоридов (NaCl). Соотношение углерода и азота должно составлять 20:1.

• Среды должны иметь достаточную влажность, обеспечивающую возможность диффузии питательных веществ в клетку.

• Важным фактором является кислотность среды. Большинство микроорганизмов развиваются при нейтральной или слабощелочной реакции среды. Грибы обычно развиваются в более кислой среде, чем бактерии. Есть среди бактерий кислотоустойчивые (молочнокислые, уксуснокислые), ацидофильные (Acetobacter acidophillus) и щелочеустойчивые (уробактерии). В процессе стерилизации сред и культивирования микроорганизмов рН может изменяться. Чтобы избежать этого, в среду добавляют буферные системы (фосфатные буферы) или мел.

• Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, определяющим насыщение их кислородом (rН₂). По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначит любую степень аэробности: насыщенный кислородом раствор обозначают rН₂=41, насыщенный водородом - rН₂=0. Анаэробы размножаются при rН₂<5, аэробы – при rН₂>10.

• Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т.е.осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Большинство бактерий могут расти на средах с 0.1-10% NaCl.

• Среды должны быть стерильными, чтобы обеспечить рост чистых культур микроорганизмов.

Дата добавления: 2015-02-05 | Просмотры: 1037 | Нарушение авторских прав