АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Классификации питательных сред

По происхождению питательные среды можно разделить на натуральные, синтетические, полусинтетические.

Натуральными обычно называются среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие неопределенный химический состав. Основой таких сред являются злаки, травы, овощи, фрукты, молоко, животные ткани, кровь, сыворотка, мясо, почва, вода морей, озер и минеральных источников, яйца, шерсть, дрожжи. Большинство из них используется в виде экстрактов, отваров, настоев. Примеры таких сред – мясо-пептонный бульон (МПБ) для гетеротрофов, неохмеленное пивное сусло для дрожжей, почвенная выдержка для почвенных микроорганизмов. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей.

Компонентами полусинтетических сред наряду с соединениями известного состава (углеводы, фосфаты, нитраты и др.) являются натуральные продукты неопределенного состава (мясной отвар, пивное сусло). Такие среды находят широкое применение в промышленной микробиологии.

Синтетические среды – это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Эти среды готовят только на дистиллированной воде. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов.

В последние годы в целях экономии питательных сред и ускоренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так называемые микротест-системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях. По назначению среды делят на:

1. Универсальные (МПА, МПБ и др.). На них растут многие микроорганизмы.

2. Специальные. Эти среды применяют для выращивания бактерий, не размножающихся на универсальных средах. Среди специальных сред различают элективные и дифференциально-диагностические. Элективные (избирательные) среды подобраны таким образом, чтобы обеспечить наиболее благоприятные условия для выращивания определенных микроорганизмов. Их применяют для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для получения накопительных культур. К таким средам относятся среда Эшби для Azotobacter, среда Виноградского для Clostridium. Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К таким средам относят среды с молоком, желатином, на которых определяют протеолитические свойства микробов. В состав дефференциально-диагностических сред могут входить индикаторы (феноловый красный, метиленовый синий и т.д.), которые, изменяя окраску при различных значениях рН, указывают на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления вводимого в среду субстрата. Примером таких сред является среда Эндо, применяемая для выделения и определения бактерий кишечной группы, на которой колонии кишечной палочки окрашиваются в красный цвет с металлическим блеском.

По физическому состоянию среды разделяются на жидкие, плотные, сыпучие. Для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения чистых культур, в диагностических целях, для хранения и количественного учета микроорганизмов и в ряде других случаев. Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатин и кремнекислый гель.

Агар-агар – сложный полисахарид, получаемый из бурых водорослей, который образует гель с точкой плавления 96-100°С и температурой застывания 40°С. Плотные питательные среды получают, добавляя к жидким 1.5-2% агар-агара.

Желатин – вещество белковой природы, которое получают из костей и хрящей животных при их вываривании. Его добавляют к средам в количестве 10-20%. Образуемый желатином гель плавится при 23-25°С и застывает при 20°С, а также разжижается под действием протеолитических ферментов многих микроорганизмов, в связи с чем используется ограниченно.

Кремнекислый гель (силикагель) образуется из силикатов калия или натрия и соляной кислоты. Хорошо промытые и стерильные гелевые пластинки в чашках Петри пропитывают стерильной питательной средой. Преимуществом силикагеля является то, что он представляет собой минеральное соединение и пригоден для культивирования автотрофов (например, нитрифицирующих бактерий).

Приготовление питательных сред. Подготовленные навески ингредиентов помещают в стеклянную колбу или кастрюлю, доливают требуемое количество бульона или дистиллированной воды, кипятят на электрической плитке до растворения всех компонентов, устанавливают необходимое значение рН: сначала с помощью индикаторной бумажки, а затем потенциометра.

Фильтрование. Жидкие питательные среды фильтруют через двойной складчатый фильтр из фильтровальной бумаги, предварительно смоченной водой, или через фильтровальное полотно, которое накладывают на стеклянную воронку. Полотняные фильтры значительно практичнее бумажных, так как годны к употреблению в течение длительного времени, в то время как бумажные фильтры употребляются лишь однократно. Рекомендуется иметь отдельные полотняные фильтры для каждого вида среды.

Агаровые среды в расплавленном состоянии лучше всего фильтруются через ватно-марлевый фильтр: стеклянную воронку покрывают марлевой салфеткой такого размера, чтобы концы салфетки были перекинуты через края воронки наружу; затем на марлю кладут слой гигроскопической ваты, фильтр смачивают горячей дистиллированной водой. Агар наливают на фильтр горячим.

Желатиновую среду фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный дистиллированной водой. Желательно фильтрацию производить быстро в теплом помещении.

Розлив сред. После осветления и фильтрации питательные среды разливают в колбы, флаконы, пробирки, бутыли или матрацы. Питательные среды закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы с питательными средами надевают бумажные колпачки. Для разливки жидких питательных сред пользуются одной из описанных ниже установок.

При розливе сред края посуды нельзя смачивать питательной средой, так как ватно-марлевые пробки, приклеиваясь к стеклу во время стерилизации, вынимаются с трудом и оставляют в просвете отверстия сосуда остатки ваты. Попадая в среду, они могут вызывать загрязнение ее посторонней микрофлорой.

Разливка плотных стерильных питательных сред в чашки Петри. Плотную питательную среду (агар, желатин) во флаконах или пробирках растапливают в водяной бане (сняв предварительно бумажные колпачки). Среду охлаждают до температуры 45-50°С, сосуд берут в правую руку, левой рукой над огнем вынимают пробку и держат ее между мизинцем и ладонью, а края флакона или пробирки обжигают. Открытую посуду со средой держат в наклонном положении, чтобы избежать попадания в среду микробов из воздуха. В асептических условиях вносят стерильную кровь, сыворотку или другие необходимые добавки, тщательно перемешивают содержимое сосуда. Левой рукой приподнимают с одной стороны крышку чашки Петри и выливают в нее питательную среду в количестве 15-20 мл, слегка покачивая чашку, чтобы среда распределялась равномерным слоем по ее поверхности.

В настоящее время ряд фирм изготовляют приборы-автоматы для разливки агаризованных сред в чашки Петри, обеспечивающие высокую стерильность и точное дозирование разливаемых сред.

При застудневании агара образуется большое количество конденсационной воды, которая оседает на внутренней стороне крышки и увлажняет поверхность среды. В связи с этим перед посевом среды подсушивают: чашку в открытом виде помещают в термостат таким образом, чтобы крышка служила опорой для края ее дна, перевернутого средой вниз. Чтобы избежать образования конденсированной влаги, чашки с расплавленным агаром тотчас после заливки накрывают листом фильтровальной бумаги, которую стерилизуют вместе с чашкой. Бумага не должна касаться поверхности среды. Когда среда окончательно остынет, фильтровальную бумагу снимают, а чашки закрывают крышками

Задание: подготовить питательную среду для культивирования микроорганизмов.

Материал и оборудование: сухие питательные среды, агар, колбы на 75-100 мл., цилиндры на 100 мл., пипетки.

Демонстрация.

Ингредиенты, используемые для приготовления питательных сред. Техника приготовления основных питательных сред. Определение рН питательного бульона.

ТЕМА: МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Работа 6. Стерилизация питательных сред, посуды и инструментария

Стерилизация – один из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает обеспложивание. В микробиологии под стерилизацией понимают гибель всех живых микроорганизмов. Микробиологи стерилизуют среды, посуду, инструменты и другие необходимые предметы, чтобы не допустить развития посторонней микрофлоры в исследуемых (культурах.

Стерилизация питательных сред и посуды – обязательный момент в работе при выполнении всех задач практикума.

Стерилизация

- физическая

- химическая

- биологическая.

Физическая стерилизация подразделяется на термическую и холодную.

Термическая стерилизация - стерилизация под действием высоких температур, вызывающих денатурацию клеточных белков, разрушающих осмотический барьер клеток, нарушающих равновесие ферментативных реакций, что приводит к гибели клетки.

Термическая стерилизация осуществляется различными способами:

1. Прокаливание в пламене горелки. Так стерилизуют бактериальные петли, иглы, кончики пинцетов, горлышки колб и пробирок, ватные пробки (кратковременно).

2. Кипячение. Производят в стерилизаторе. Стерилизуют шприцы, ножницы, скальпели, пинцеты, резиновые перчатки и резиновые пробки.

3. Стерилизация сухим жаром. Осуществляется в сушильных шкафах при температуре 160°С - 2 ч., 165°С - 1 ч., 180°С - 40 мин. Горячим воздухом чаще всего стерилизуют стеклянную посуду.

4. Стерилизация влажным жаром (текучим паром). Производится в аппарате Коха или в автоклаве при открытом выпускном кране. Таким образом стерилизуют питательные среды, свойства которых изменяются при температурах выше 100°С. Обработку материала текучим паром используют для проведения дробной стерилизации (тиндализации) – трехкратной обработки питательной среды влажным жаром в течение одного часа при температуре 70-80°С с интервалами 24 ч., во время которых поддерживается температура, благоприятная для прорастания спор. Проросшие из спорвегетативные клетки быстро погибают при очередном нагревании.

5. Стерилизация влажным жаром под давлением (автоклавирование). Наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации питательных сред. Основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Время стерилизации 10-45 мин. Температура пара возрастает при повышении его давления:

Температура пара (С⁰) Давление (атм.)

112 0.5

121 1

128 1.5

132 2

Подготовка сред к стерилизации. Каждую питательную среду стерелизуют определенным способом в зависимости от ее состава. Среды, предназначенные для стерилизации в автоклаве, наливают не выше половины высоты сосуда. Сосуды со средами закрывают ватными пробками, которые предохраняют среду от заражения микроорганизмами, находящимися в окружающем воздухе. Поэтому пробки должны быть достаточно плотными, с равномерным распределением волокон ваты. Однако слишком плотные пробки делать не следует, так как они затрудняют снабжение культур воздухом. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизоваться в автоклаве, целлофаном или другими материалами, не пропускающими пар. Пар должен обязательно проникать через пробку в сосуд, иначе среды не нагреются до нужной температуры и не простерилизуются. После стерилизации среды выдерживают 2-3 суток в термостате при 30° для проверки стерильности. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.

Режимы стерилизации питательных сред.

Температура и длительность автоклавизования определяются прежде всего составом питательной среды. Субстраты, содержащие вещества, не выдерживающие нагревания до 120°, стерилизуют при 0.5 атм. Молоко, дрожжевой автолизат, дрожжевую воду и среды с желатиной стерилизуют при 0.5 атм. в течение 15 мин. Среды, содержащие сахара и витамины, например сусло пивное, соки, стерилизуют при 0.5 атм. 20-30 мин. Мясопептонный бульон и мясопептонный агар автоклавируют при 1 атм 20-30 мин., картофельную среду и почвенную вытяжку, при 1.5 атм 30 мин.

Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать рН среды. В случае кислой реакции среды при автоклавировании могут подвергнуться гидролизу входящие в ее состав полимеры. Так, если рН среды ниже 6.5-6.0, то происходит пептонизация желатины, и среда после стерилизации не застывает. При рН ниже 5.0 частично гидролизуется и теряет способность образовывать гель агар-агар.

Если среда щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли железа, карамелизуются и становятся недоступными для микроорганизмов сахара. Чтобы избежать этих явлений, среды, предназначенные для культивирования кислотолюбивых или щелочелюбивых микроорганизмов, стерилизуют при нейтральном значении рН и только после автоклавирования подкисляют или подщелачивают. Кроме того, растворы ряда компонентов часто стерилизуют отдельно при таком рН и в том режиме, три которых они не изменяются, а затем стерильно добавляют в среды в нужном количестве.

6. Неполная стерилизация (пастеризация). Достигается выдерживанием материала при 60°С в течение 30 мин., при 75°С - 15 мин., при 90°С - без выдержки. Широко применяется для частичной стерилизации легко портящихся пищевых продуктов (молоко, соки, сиропы). В почвенной микробиологии пастеризуют суспензии почв, чтобы освободить их от вегетативных клеток, но сохранить споры бактерий.

Методы холодной стерилизации применяют в тех случаях, когда среды не выдерживают нагревание.

Холодная стерилизация включает в себя:

1. Фильтрацию, которая заключается в пропускании жидкостей через специальные фильтры, имеющие мелкопористые перегородки и поэтому

задерживающие клетки микроорганизмов. Причем здесь имеет место не только механическая задержка, но и адсорбция микроорганизмов на стенках, ограничивающих поры, вследствие того, что большинство микроорганизмов в водных суспензиях несет на свой поверхности отрицательный заряд, а фильтры изготавливаются из положительно заряженных материалов. Диаметр пор определяет область применения фильтров (фильтрующее и стерилизующее действие). Используют следующие типы фильтров:

• Мембранные фильтры (пористые диски из целлюлозы, коллодия, ацетата, толщиной около 0.1 мм с диаметром пор от 0.35 до 1.2 мкм).

• Фильтры Зейтца (диски из смеси асбеста с целлюлозой). С увеличением содержания целлюлозы пористость фильтра возрастает.

• Мелкопористые стеклянные фильтры (диски из фрагментов стекла получаемые путем его сплавливания).

• Фарфоровые фильтры в виде полых свечей из каолина с примесью кварцевого песка (свечи Шамберлана), из инфузорной земли (свечи Беркефельда) и других материалов.

Фильтр, представляющий собой диск, закрепляется в специальном держателе (стеклянном, металлическом), который вставляется в приемник фильтрата (колба Бунзена). Свечи вставляют непосредственно в резиновую пробку приемника. Перед употреблением фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизованы.

Обычно фильтрование ускоряется путем создания на фильтре перепада давления, достигаемого либо приложением повышенного давления к находящейся над фильтром жидкости, либо откачиванием воздуха с помощью вакуумного насоса, присоединенного к приемнику фильтрата.

Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны на одноразовое использование. Свечи после специальной обработки можно использовать повторно.

2. Стерилизацию облучением, основанную на летальном эффекте, которое оказывают на клетки микроорганизмов ультрафиолетовые, рентгеновские, g-, a-, b-лучи и нейтроны. В лабораторных условиях обычно используют ультрафиолетовые лучи, источником которых являются специальные бактерицидные лампы. Излучателем в них служит электрическая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления и испускающая линейчатый спектр в ультрафиолетовой области с длиной волны 260 нм. Бактерицидные лампы используют для частичной стерилизации открытых поверхностей и воздуха. Применение ультрафиолета ограничено из-за его малой проникающей способности. Вегетативные формы бактерий более чувствительны к УФ-облучению, чем споры.

3. Стерилизацию ультразвуком, создаваемым в жидкостях при помощи вибрирующих никелевых или кварцевых дисков. Разрушение клеток при ультразвуковом воздействии обусловлено возникновением вторичных явлений - кавитации. В результате действия звуковой волны высокой частоты образуются разрывы в жидкости, которые затем образуют пузырьки. При их захлопывании идет сильная гидравлическая волна, достигающая 10 атм., что приводит к механическому разрушению клеток. Бактерицидный эффект ультразвука снижается, если подавляется кавитация (разрыв жидкости), что происходит при дегазации, погружении объекта в гель или другую вязкую среду. Бактерицидный эффект ультразвука напротив усиливается при насыщении озвучиваемой эмульсии углекислотой, азотом, кислородом, воздухом, так как это усиливает кавитацию. К ультразвуку чувствительны все микроорганизмы, в том числе и споровые. Но по степени чувствительности они значительно отличаются.

Химическая стерилизация представляет собой удаление или разрушение микроорганизмов, находящихся на неживых объектах или поверхностях, с помощью химических агентов, получивших название дезинфицирующих веществ. В качестве дезинфицирующих агентов применяют галогены и их производные (гипохлорид натрия, хлорамины, спиртовой раствор йода), фенольные соединения, спирты, микробоцидные газы (формальдегид, окись этилена). Для консервации питательных сред, вакцин и сывороток используют хлороформ, толуол, эфир, формалин и др.

Биологическая стерилизация основана на применении антибиотиков.

Приготовление к употреблению стерильные питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37°С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сут., простерилизованные текучим паром - 3 суток.

Стерилизация стеклянной посуды

Основным способом стерилизации стеклянной посуды является стерилизация горячим воздухом. Она осуществляется в сушильных шкафах при 165-180° в течение 2 часов. При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Подготовка посуды к стерилизации. Посуду перед стерилизацией тщательно моют, сушат и завертывают в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. Каждую пипетку заворачивают отдельно в длинные полоски бумаги, шириной 4-5 см. В концы пипеток, которые берутся в рот, предварительно вставляют ватные тампоны; обмотку начинают с противоположного конца. Постепенным движением бумаги по спирали оканчивают обмотку у конца с тампоном. Бумага должна плотно охватывать пипетку. Завернутые пипетки для предохранения бумаги от загрязнения и разрывов заворачивают по нескольку штук вместе или помещают в специальные металлические или картонные пеналы. Шпатели обертывают по отдельности, а потом, как и пипетки, объединяют. Чашки Петри завертывают вмести по 2-1 штуки. Колбы, пробирки и трубки Бури закрывают ватными пробками.

Стерилизация. Посуду, подготовленную к стерилизации, загружают в сушильный шкаф не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный прогрев стерилизующихся предметов. Плотно закрывают дверцу шкафа и вентиляционное отверстие, включают нагревающее устройство. Отмечают время, когда температура в шкафу достигнет 165-180°. Поддерживают эту температуру в течение двух часов, если шкаф не снабжен терморегулятором, необходимо все время следить за температурой, так как при понижении ее посуда не простерилизуется, а при нагреве свыше 180° бумага и пробки начинают обугливаться. По окончании стерилизации выключают нагревающее устройство. Шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 80°, так как при резком охлаждении может нарушиться стерильность материала и треснуть сильно нагретое стекло.

Простелизированную посуду хранят в закрытом, защищенном от пыли месте. Развертывают ее непосредственно перед использованием.

Задание: ознакомиться с методами стерилизации различных питательных сред, стеклянной посуды и инвентаря. Подготовить и простерилизовать питательные среды.

Материалы и оборудование: МПБ, агар, лакмус красный, стеклянные палочки, 20%-ный раствор Na₂CO₃, пробирки в штативах, воронки, вата, марля, чашки Петри, пипетки Мора на 1 мл, бумага для обертывания чашек и пипеток, колбы емкостью 250 мл., суровые нитки.

ТЕМА: УЧЕТ ЧИСЛЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Работа 7. Метод высева на плотные среды (метод Коха)

Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колонии. При этом считают, что каждая колония является результатом размножения одной клетки.

Чашечный метод широко используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в субстратах. Он позволяет учесть не только численность микроорганизмов в субстрате, но и оценить иx разнообразие по морфологии колонии.

Приготовление разведений. Разведения делают в стерильном 0.5%-ном водном растворе NaCl. Готовят определенный объем этого раствора и стерилизует его при 1 атм. В ходе одного опыта пользуются постоянным коэффициентом разведения, так как в этом случае уменьшается вероятность ошибки. Чаще всего делают десятичные разведения. Для этого стерильный раствор NaCl разливают стерильной пипеткой по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем переносят стерильной пипеткой 1 мл исследуемого материала в пробирку с 9 мл стерильного раствора NaCl. Если исследуемый материал (например, почва) уже был разведен в 100 раз, получают разведение 1:10³. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру повторяют 3-5 раз, что обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробирку – это разведение 1:10⁴. Таким образом готовят и последующие разведения. Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.

Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку. Пренебрежение этим (правилом может привести к получению ошибочного результата, иногда в 100 и более раз превышающего истинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата.

Посев на агаризованные среды в чашки Петри. В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Затем их в большинстве случаев выдерживают 2-3 суток при 30° крышками вниз для подсыхания поверхности среды и проверки ее стерильности. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Когда используют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре после застывания агара.

Посев делают из определенных разведений в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0.05, 0.1 или 0.2 мл) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материал не вносили. При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относительно невелико, посевной материал распределяют по поверхности среды только в одной чашке Петри.

Из каждого разведения делают таким образом 4-6 параллельных высевов. Для параллельных рассевов из одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений используют новую стерильную пипетку и новый шпатель. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов.

Подсчет выросших колоний проводят через определенное время после посева, которое зависит от скорости роста выявляемых микроорганизмов на используемой в опыте среде и при данной температуре.

Подсчитывают количество колоний, выросших при высеве из определенного разведения на двух (одной) чашках Петри. Результаты параллельных высевов суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из этого разведения. Колонии, как правило, считают, не открывая чашки Петри. Для удобства отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь стеклографом пли чернилами по стеклу. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют.

Следует иметь в виду, что точность метода зависит от числа подсчитанных колоний, а не от числа повторностей. Лучшим разведением считают то, при высеве из которого на плотной питательной среде вырастает от 50 до 150.колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасывают и для paсчетов количества клеток в исходном субстрате не используют. Желательно, чтобы общее количество подсчитанных колоний при высеве разведения было не менее 300.

Задание: приготовить серийные развития микроорганизмов, сделать посев на чашки Петри по схеме.

Материалы и оборудование: стерильные колбы на 250 мл., стерильные пипетки на 2 мл., пипетки Мора на 1 мл., стерильные чашки Петри с МПА, шпатели.

ТЕМА: ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИРКООРГАНИЗМОВ

Работа 8. Особенности роста микроорганизмов на плотных средах

Признаки, выявляемые при развитии культур микроорганизмов на питательных средах, носят название культуральных. К ним относятся: характер роста на различных (твердых, жидких) питательных средах, тип колонии, способность к разжижению желатина и некоторые другие.

К культуральным признакам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

Рост микроорганизмов на плотных питательных средах.

На поверхности плотных питательных сред микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонией называют видимые простым глазом изолированное скопление клеток одного вида на поверхности субстрата, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. Споры или отдельные клетки микробов, попадая при посеве на определенное место плотного субстрата, не могут как в жидкости рассеиваться по всей среде, а прорастают и размножаются на одном и том же месте, образуя колонии.

В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием и являются наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотном субстрате.

При учете посевов принято описывать выросшие на чашках колонии по определенной схеме. При этом учитывают следующие признаки:

форму колонии – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т.д.;

размер (диаметр) колонии измеряют в мм: колония крупная - больше 10 мм, средняя - 1-10 мм, если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют точечными;

поверхность колонии – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

профиль колонии – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т.д.;

блеск и прозрачность – колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;

цвет колонии – бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная - белая, желтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная. Особо отмечают выделение пигмента в субстрат. При описании колоний актиномицетов отмечают пигментацию воздушного и субстратного мицелия, а также выделение пигментов в среду

край колонии – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.;

структуру колонии – однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая и т.д. Край и структуру колонии определяют с помощью лупы или при малом увеличении микроскопа. Для этого чашку помещают на столик микроскопа крышкой вниз;

консистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, пленчатой (снимается целиком), хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей).

Глубинные колонии, напротив, довольно однообразны. Чаще всего они по виду похожи на более или менее сплющенные чечевички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными концами. Лишь глубинные колонии немногих бактерий напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если развивающиеся микроорганизмы выделяют углекислоту или другие газы. Донные колонии самых разнообразных микроорганизмов имеют вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

Размеры и некоторые другие особенности колоний изменяются с возрастом и зависят от состава среды, поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды и температуру культивирования.

При описании роста микроорганизмов по штриху отмечают следующие особенности: скудный, умеренный или обильный, сплошной с ровным или волнистым краем, четковидный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоидный. Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверхность и консистенцию.

Рост микроорганизмов в жидких средах более однообразен и сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Характеризуя рост в жидкой среде, отмечают степень помутнения - слабая, умеренная или сильная, особенности пленки - тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая, а при образовании осадка указывают - скудный он или обильный, плотный, рыхлый, слизистый или хлопьевидный.

Нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Последнее обнаруживают по образованию пены, пузырьков, а также с помощью «поплавков» - маленьких, запаянных с одного конца трубочек. Поплавок помещают в пробирку запаянным концом вверх перед стерилизацией среды и следят, чтобы он полностью был заполнен средой. В случае выделения газа он скапливается в поплавке в виде пузырька.

Материалы и оборудование: чистые культуры бактерий на МПА, бактериологическая петля.

Работа 9. Влияние ультрафиолетовых лучей на микроорганизм

Энергия, распространяющаяся в пространстве в виде электромагнитных волн, называется лучистой энергией. Различные ее спектры оказывают на микроорганизмы неодинаковое воздействие. Радиоволны не оказывают биологического действия, инфракрасные - при адсорбции их организмом вызывают нагревание. Видимый свет действует на фотосинтезирующие микроорганизмы благоприятно, являясь основным источником энергии. Все остальные бактерии лучше развиваются в темноте. Даже рассеянный свет задерживает их размножение. А видимый свет значительной интенсивности может вызывать повреждение и гибель, клеток. От губительного действия видимого света микроорганизмы предохраняет способность образовывать пигменты.

Наиболее активно на бактерии действует ультрафиолетовая часть спектра, оказывающая либо летальное, либо мутагенное действие в зависимости от природы микроба и дозы облучения.

Лабораторный опыт по влиянию ультрафиолетовых лучей на жизнедеятельность микроорганизмов закладывается следующим образом. В стерильную чашку Петри с МПА вносят каплю суспензии бактерий, которую равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского. Затем на центральную часть сплошного газона микроорганизмов помещают стерильный трафарет, и, открыв чашку, ставят ее под облучатель кварцевой лампы на 20-30 мин на расстоянии от источника излучения 10-20 см. Затем трафарет убирают, чашки закрывают и инкубируют при 28°С. Результаты опыта наблюдают через 5-7 дней. Рост микроорганизмов виден лишь на том участке агара, который был закрыт трафаретом от действия ультрафиолетовых лучей. Остальная часть среды стерильна. Губительное действие лучей зависит от расстояния, времени экспозиции и вида микроорганизма, который подвергался облучению.

Задание.

Изучить чашку Петри, подвергнутую облучению УФЛ. Результаты наблюдения занести в тетрадь и сделать рисунок.

Материалы и оборудование: чистые культуры бактерий на МПА.

Работа 10. Чувствительность к актибиотикам

Антибиотики – это специфические вещества, образуемые клеткой в процессе жизнедеятельности, а также их производные и синтетические аналоги, обладающие способностью подавлять развитие микроорганизмов или задерживать развитие злокачественных новообразований.

Антибиотики отличаются от неспецифических метаболитов (кислоты, спирты), высокой биоактивностью в отношении чувствительных микроорганизмов. Их действующие концентрации выражаются в микрограммах или даже десятых и сотых долях мкг/мл.

Антибиотики обладают избирательностью биологического действия. Не все микроорганизмы, находясь в контакте с антибиотиком, чувствительны к нему, и поэтому делятся на чувствительные и резистентные (устойчивые).

Одни антибиотики подавляют рост небольшого числа видов микроорганизмов и являются антибиотиками узкого спектра действия (бензилпенициллин, новобиоцин, гризеофульвин), другие угнетают рост многих микроорганизмов – антибиотики широкого спектра действия (тетрациклины, хлорамфеникол).

Антибиотики могут подавлять развитие микроорганизмов (бактериостатическое действие), убивать их (бактерицидное действие) и растворять (бактериолитическое действие).

Для доказательства антибиотической активности и избирательности действия антибиотиков на микроорганизмы ставится следующий опыт. В чашку Петри засевают сплошным газоном культуру микроорганизма и накладывают стерильным пинцетом бумажные диски, пропитанные различными антибиотиками, на равном расстоянии друг от друга и на 1.5-2 см. от края чашки. Через 2 часа чашки помещают в термостат при 28-30°С на 24 часа. Если исследуемые микроорганизмы чувствительны к данным антибиотикам, то вокруг дисков образуются зоны отсутствия роста. Диаметр зоны измеряют миллиметровой линейкой.

Может быть установлено три результата: антибиотик не действует на микроорганизм (зона отсутствует), антибиотик действует слабо (диаметр зоны < 15 мм.), среднее действие антибиотика (диаметр зоны от 15 до 25 мм.), антибиотик оказывает сильное действие (диаметр > 25 мм.).

Действие антибиотиков на рост бактерии

Задание. Рассмотреть и зарисовать чашки с опытом по определению действия антибиотиков на микроорганизмы. Замерить зоны отсутствия роста микробов вокруг дисков с антибиотиками. Сделать вывод.

Материалы и оборудование: Чистые культуры бактерий на МПА, стерильные пипетки Мора на 1 мл, бактериологические иглы, чашки Петри с пластинами МПА, шпатели Дригальского, бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками.

Работа 11. Демонстрация постулатов Коха в экспериментах с растениями

Великий немецкий микробиолог Роберт Кох (1843-1910) начал свои исследования в то время, когда роль микроорганизмов в возникновении инфекционных заболеваний подвергалась серьезным сомнениям.

Для доказательства этой роли требовались четкие критерии, которым должны удовлетворять эксперименты, подтверждающие причинную связь между данным микроорганизмом и определенной болезнью. Эти критерии были сформулированы примерно за 30 лет до работ Коха другим немецким микробиологом – Ф.Генле, но вошли в историю под названием «постулаты Коха», поскольку именно Р.Кох впервые применил их в эксперименте, изучая бактериальную этиологию сибирской язвы. Суть постулатов заключалась в следующем:

1) один и тот же микроорганизм – предполагаемый возбудитель болезни, должен обнаруживаться во всех случаях данного заболевания и не выделяться при других болезнях и от здоровых лиц;

2) микроб-возбудитель должен быть выделен из организма больного и поддерживаться в чистой культуре;

3) чистая культура данного микроорганизма должна вызывать у восприимчивого хозяина (экспериментально зараженных животных) заболевание с клинической и патологоанатомической картиной, аналогичной заболеванию человека, из организма которого выделена чистая культура;

4) микроб-возбудитель должен быть снова выделен из организма эксперимента, но зараженного животного и его свойства должны быть идентичны первому изоляту.

Роль микроорганизмов в возникновении инфекционных заболеваний была доказана Кохом только после того, как им был разработан и начал активно использоваться в медицине метод выделения чистых культур микроорганизмов на плотных питательных средах из отдельной колонии. Например, Кох окончательно доказал, что ранее обнаруженный у животных, больных сибирской язвой, микроорганизм отвечает требованиям постулатов и является истинным возбудителем данного заболевания и у людей. Хотя Кох работал с животными, его постулаты можно продемонстрировать и с использованием растений.

Микроорганизмы и их культивирование. В работе используют яблоко или клубень картофеля с гладкой неповрежденной кожицей, подверженные гниению в результате спонтанного развития гнилостной микрофлоры на начальном этапе процесса.

Основным методом работы является метод выделения чистой культуры микроорганизма на плотной питательной среде.

Для выделения чистой культуры из гниющего картофеля используют мясо-пептонный агар, а из гниющего яблока – среду Сабуро состава (г/л): глюкоза – 20,0; пептон – 10,0; агар – 18,0; вода водопроводная – до 1 л. Значение рН среды Сабуро до стерилизации доводят до 5.6-5.8. Стерилизацию проводят при 0.5 атм 30 мин.

Питательную среду, предназначенную для работы по выделению чистой культуры, расплавляют и разливают в стерильные чашки Петри из расчета 12 чашек (около 250 мл) на один объект изучения.

Описание характера поражения. Перед выделением из яблока (или клубня картофеля) культуры микроорганизма, вызывающего гниение, объект осторожно моют водой с мылом и характеризуют внешние признаки поражения – отмечают изменения цвета и консистенции пораженных микроорганизмами участков поверхности кожицы. Затем яблоко (или клубень) протирают ватой, смоченной 70%-м этиловым спиртом, и помещают в стерильный стеклянный сосуд.

Выделение культуры возбудителя процесса гниения. Для выделения культуры возбудителя процесса гниения стерильной иглой или скальпелем делают в кожице яблока или клубня в месте поражения отверстие диаметром 3-4 мм. Из этого отверстия стерильно, с помощью бактериологической петли берут небольшой комочек гниющей ткани и переносят в пробирку с 6-7 мл стерильной водопроводной воды. Содержимое пробирки энергично перемешивают встряхиванием. Выделение культуры возбудителя процесса гниения проводят с помощью бактериологической петли методом истощающего штриха. Используют 3 чашки Петри с соответствующей стерильной средой. Кроме того, для получения чистой культуры используют стеклянные шпатели Дригальского. С этой целью петлю («зеркальце») суспензии гнилостных микроорганизмов наносят на поверхность стерильной среды в чашке Петри, а затем распределяют микроорганизмы стерильным шпателем и, не обжигая шпатель в пламени горелки, распределяют материал по 2-й и 3-й чашкам Петри со стерильной средой. Засеянные чашки инкубируют в термостате при 30^оС в течение 2-3 сут. (картофель) и 5-7 сут. (яблоко). Выросшие колонии описывают и проводят изучение морфологии клеток возбудителя процесса гниения, используя препарат «раздавленная капля» и объектив х40 при работе с яблоком и, кроме того, окрашенный фуксином препарат (объектив х100), при работе с картофелем.

Экспериментальное заражение восприимчивого «хозяина». Здоровое яблоко или клубень картофеля моют с мылом, протирают 70%-м спиртом и помещают в простерилизованный спиртом сосуд. Затем раскаленной бактериологической иглой делают на поверхности здорового объекта 2 колотых отверстия глубиной около 1-2 см. Иглу опять стерилизуют в пламени и с ее помощью заражают оба отверстия здорового яблока или клубня картофеля чистой культурой, выделенной из гниющих яблока или клубня соответственно. Зараженный объект инкубируют в стеклянном сосуде при 30°С в течение 5-7 сут. (яблоко) или 2-4 сут. (картофель).

Изучение культуры возбудителя процесса гниения из организма экспериментально зараженного объекта. Характер экспериментального поражения поверхности яблока или клубня описывают и сравнивают с таковым у спонтанно гниющих яблока или клубня. Для подтверждения четвертого постулата Коха можно провести повторное выделение культуры, вызывающей гниение, из экспериментально зараженного объекта. Выросшие колонии описывают и изучают морфологию клеток возбудителя процесса гниения под микроскопом. Однако достаточно провести только микроскопическое изучение гниющих тканей яблока или клубня и сравнить результаты с данными, полученными при выделении культуры возбудителя процесса гниения.

Задание: подтвердить в эксперименте основные постулаты Коха.

Материалы и оборудование: посуда, реактивы (на 1 студента).

Пробирки – 1 шт.; колба на 500 мл; реактивы для приготовления сред; 12 чашек Петри; гниющие и здоровые яблоки или клубни картофеля; микроскоп; покровные и предметные стекла; фуксин.

Работа 12. Моделирование процесса возникновения эпидемии на примере культуры пекарских дрожжей

Эпидемия – относительно кратковременное, быстрое и непрерывное распространение инфекционного заболевания в пределах какой-то совокупности организмов в определенном регионе. При этом регистрируется заболеваемость намного выше обычно существующего уровня. Распространение инфекционного заболевания людей или животных на территории целой страны, континента или всей суши называется эпидемией. Инфекционное заболевание, или инфекция (от лат. infectio – заражение), представляет собой совокупность физиологических и патологических адаптационных и реарационных реакций, которые возникают и развиваются в макроорганизме в процессе взаимодействия с патогенными микроорганизмами.

Формы инфекции разнообразны и носят различные наименования в зависимости от природы возбудителя, его локализации в макроорганизме и путей распространения, экзогенная инфекция возникает в результате заражения патогенными микроорганизмами, поступившими в организм из окружающей среды с пищей, водой, воздухом, почвой, выделениями больного человека или микробоносителя. Часто распространение инфекционных болезней происходит при несоблюдении элементарных правил гигиены.

Микроорганизмы и их культивирование. В работе используют культуры пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи выращивают в пробирках с сусло-агаром в течение 3 сут. при 30°С и хранят в холодильнике при 4°С.

Основным методом работы является получение культуры дрожжей с поверхности ладоней и пальцев человека методом смыва с последующим высевом смытой суспензии на плотную питательную среду.

Для опытов используют 3-суточную культуру S.cerevisiae, полученную на сусло-агаре при 30°С.

Группу студентов разделяют на подгруппы по 4 человека в каждой. На подгруппу готовится 4 чашки Петри с сусло-агаром. Каждую чашку нумеруют. Все студенты подгруппы тщательно моют руки с мылом и стерилизуют их 70%-м этанолом

Контрольный тест для доказательства чистоты рук. Чтобы убедиться в отсутствии дрожжевых клеток на руках студентов, участвующих в эксперименте, делают смыв с ладоней и пальцев их правой руки. Первый студент с помощью стерильного ватного тампона на деревянной палочке, смоченного в стерильной водопроводной воде, делает смыв с поверхности ладони и пальцев правой руки второго студента и проводит тампоном штрих по поверхности среды в чашке Петри 2а с сусло-агаром (делает контрольный высев). В свою очередь второй студент осуществляет аналогичный смыв с ладони и пальцев правой руки первого студента и делает контрольный высев в чашку 1а. Третий и четвертый студенты производят смыв ладоней и пальцев правой руки друг другу по такой же схеме и делают контрольные высевы в чашки с сусло-агаром 3а и 4а соответственно.

Моделирование процесса возникновения эпидемии. Делают суспензию из 3-суточной культуры дрожжей S.cerevisiae, выросшей при температуре 30°С. Для этого в пробирку с выросшей культурой дрожжей, содержащую скошенный сусло-агар, стерильно вносят 3-4 мл стерильной водопроводной воды и с помощью бактериологической петли осторожно суспендируют дрожжевую массу с поверхности агара. Полученную суспензию переносят в стерильную пробирку. Студенты, входящие в экспериментальную подгруппу, еще раз моют руки с мылом, протирают их 70%-м этанолом и дают высохнуть. Затем студент-инструктор или преподаватель протирает с помощью ватного тампона на палочке, смоченного суспензией S.cerevisiae, поверхность ладони и пальцев правой руки первого студента. Он обменивается энергичным рукопожатием правой рукой со вторым студентом. Тот пожимает правую руку третьего студента, а он в свою очередь обменивается рукопожатием с четвертым студентом.

Выделение культуры возбудителя «инфекционного процесса». Для выделения культуры дрожжей с поверхности ладоней и пальцев правой руки студентов используют стерильные ватные тампоны на деревянной палочке, слегка смоченные стерильной водопроводной водой. Студенты – первый и второй, третий и четвертый – делают смывы ладоней и пальцев правых рук друг друга и высевают смывы на чашки 16, 26, 36 и 46 соответственно. Для получения отдельных колоний дрожжей, смытых тампонами с рук, штрих на чашке Петри с сусло-агаром распределяют по всей поверхности чашки бактериологической петлей методом «истощающего штриха». Делают контрольный высев на сусло-агар суспензии дрожжей, использованной в эксперименте, бактериологической петлей методом «истощающего штриха». Засеянные чашки со средой инкубируют в течение 3 сут при температуре 30°С. Выросшие колонии на чашках просматривают, определяют интенсивность роста — скудный, умеренный или обильный. При возможности подсчитывают количество колоний на чашках. Делают препараты «раздавленная капля» из колоний дрожжей в чашках 16, 26, 36 и 46, а также дрожжей рабочей суспензии и просматривают их с объективом 40х. Делают выводы о способах возникновения и путях распространения экзогенной инфекции.

Задание: получение экспериментальной модели возникновения эпидемии.

Материалы и оборудование, посуда, реактивы (на 4 студентов).

Пробирки – 2 шт.; колба на 500 мл; сусло-агар; 10 чашек Петри; микроскоп; покровные и предметные стекла; пинцет; стерильные ватные тампоны на деревянной палочке – 10.

Работа 13. Прямое выделение патогена

Из природных местообитаний – почва, вода, воздух, организм человека или животного – можно избирательно получать те или иные виды микроорганизмов путем прямого выделения либо путем обогащения.

Прямое выделение проводит методом рассева смешанной популяции микроорганизмов по поверхности твердой питательной среды. В результате распределения по поверхности среди конкуренции между клетками различных видов за питательные вещества существенно уменьшается, и в них условиях даже сравнительно медленно растущие организмы могут формировать колонии. Прямым высевом материала из природных местообитаний из чашки с селективной средой пользуются в тех случаях, когда хотят выделить сравнительно много видов микроорганизмов, способных расти в данных условиях.

Для получения культур из смешанной популяции путем обогащения используют посев материала в жидкую селективную (элективную) среду, в которой различные организмы постоянно конкурируют друг с другом за питательные вещества. В результате в таких накопительных культурах из всех членов внесенной в среду популяции, способных расти в данных условиях, постепенно отбираются те виды, которые растут в данных условиях с наибольшей скоростью.

Получение патогенных или условно патогенных микроорганизмов непосредственно из организма или из выделений, инфицированных болезнетворными микроорганизмами, часто проводите применением методила прямого выделения. Используют большое количество различных видов селективных сред.

Микроорганизмы и их культивирование. В работе используют бактерии Staphylococcus aureus. Этот микроорганизм обитает и носоглотке человека и считается условно-патогенным. S.aurcus выделяет энтеротоксин, является причиной некоторых видов пищевых отравлений, вызывает фурункулезы и т.п. Для получения бактерии из организма человека методом прямого выделения используют плотные селективные среды – агаризованную среду с маннитом и NaCl и стафилококковую среду 110.

Агаризованная среда с маннитом и NaCl содержит (г/л): пептон – 10.0; питательный бульон – 1.0; D-маннит – 10.0; NaCl – 75.0; феноловый красный – 0.025; агар – 15.0. Хлористый натрий ингибирует рост многих других форм бактерии. Об образовании кислоты из маннита свидетельствует желтый цвет, появляющийся в присутствии индикатора фенолового красного.

Селективный эффект стафилококковой среды 1 10 также основывается на действии 7.5%-го хлористого натрия, разжижении желатины и сбраживании маннита. Среда содержит (г/л): тринтоп – 10.0; дрожжевой экстракт – 2.5; желатина – 30; лактоза – 2.0; D-маннит – 10.0; NaCl – 75.0; K₂НРО₄ – 5.0; агар – 15.0.

Отсев S.aureus для хранения в лаборатории не производится. Все использованные питательные среды с посевами, предметные стекла и т.п. тщательно контролируются и после выполнения работы заливаются дезраствором и затем убиваются методом автоклавирования.

Основным методом работы является метод выделения чистой культуры микроорганизма на плотной питательной среде. Для получения опытного материала используют студентом учебной группы.

Выделение S.aurcus из носоглотки человека. Готовят ватные тампоны на деревянной палочке, заворачивают их в бумагу и стерилизуют в сушильном шкафу. В чашки Петри разливают питательные среды – агаризованную среду с маннитом и NaCl и стафилококковую среду 110. С помощью ватного тампона из горла или внутренней полости носа извлекаю! исследуемый материал и сразу же проводят тампоном полосу (штрих) по поверхности агаризованной среды с маннитом и NaCl. Используя второй тампон, еще раз извлекают исследуемый материал и проводят тампоном полосу по поверхности второй среды – стафилококковой среды 1 10. Полосу проводят тампоном не по центру чашек, а ближе к их краю. Стерильной бактериологической петлей распределяют исследуемый материал из полосы по всей поверхности каждой среды на чашке методом истощающего штриха. Используя вторую чашку с соответствующей средой и стерильную бактериологическую петлю, рассев материала истощающим штрихом продолжают по поверхности среды и в этой чашке. Засеянные чашки – по 2 с каждой средой, инкубируют в термостате при 35°С в течение 48 ч. Далее чашки извлекают из термостата и оставляют еще на 24 ч. в лаборатории на свету при комнатной температуре для дополнительного биосинтеза в колониях стафилококков бактериальных пигментов.

Обнаружение характерных колоний S.aureus. После экспонирования выросших колоний в течение 24 ч. в лаборатории на свету при комнатной температуре чашки с каждой из сред исследуют па наличие характерных колоний S.aureus.

Агаризованная среда с маннитом и NaCl. На этой среде условно-патогенные стафилококки S.aureus образуют крупные колонии, окруженные желтым кольцом (зоной), образовавшимся в результате реакции синтезированных при брожении маннита кислот с индикатором феноловым красным. Другие виды стафилококков образуют па агаризованной среде с маннитом и NaCl колонии меньшего размера, окруженные пурпурной пли красной зонами. Клетки из типичных колоний, окруженных желтым кольцом, красят по Граму. Положительное окрашивание клеток по Граму подтверждает принадлежность исследуемых бактерий к стафилококкам.

Стафилококковая среда 110. На среде 110 условно-патогенные формы стафилококков образуют оранжевые колонии, в то время как непатогенные формы формируют белые колонии. Типичные пигментированные колонии пересевают в пробирки с агаризованной средой 110 и через 24 ч. культивирования при 35°С красят клетки по Граму. Положительное окрашивание подтверждает, что исследуемые бактерии относятся к стафилококкам. На остаток типичной оранжевой колонии на чашке, из которой произвели пересев на скошенный агар, наносят каплю 0.25%-го спиртового раствора индикатора крезолового пурпурного. Изменение цвета колонии на желтый свидетельствует о процессе сбраживания бактериями маннита с образованием кислот. В качестве контроля наносят каплю крезолового пурпурного на участок агаризованной среды на чашке, свободный от выросших колоний стафилококков. Для обнаружения процесса разжижения желатины, вызванного действием протеолитических ферментов, на типичную оранжевую колонию наносят каплю насыщенного раствора сульфата аммония. Выдерживают чашку 10 мин. при 30°С. О положительной реакции свидетельствует появление вокруг колонии зоны просветления.

Задание: получение условно-патогенных бактерий из организма человека метолом прямого выделения с использованием плотных селективных сред.

Материалы и оборудование: пробирки, реактивы для приготовления сред, чашки Петри, микроскоп, предметные стекла, ватные тампоны на деревянной палочке в пробирках, реактивы для окрашивания клеток по Граму.

ТЕМА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 14. Микробиота человека. Микрофлора полости рта

Полость рта является исключительно благоприятной средой для существования и размножения самых различных видов микроорганизмов. Это обусловлено постоянным наличием питательных веществ, оптимальной для размножения многих микроорганизмов температурой (37°С), влажностью и pН (около 6.9-7.0). Микрофлора полости рта подразделяется на постоянную и случайную. Обычными представителями нормальной микрофлоры ротовой полости являются стрептококки: факультативно анаэробные (в том числе Streptococcu, salivarius, S. mitis, кариесогенные – S. mutatis и др.) и облигатные анаэробы (Peptostreptococcus), а также грамположительные нитевидные микроорганизмы (Actinomyces viscosus). В составе микрофлоры полости рта можно обнаружить также лактобациллы, грамотрицательные кокки, относящиеся к родам Neisseria и Velionella, а также грамотрицательные бактерии, строгие анаэробы из семейства Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia). В состав постоянной микрофлоры полости рта входят различные виды спирохет (Treponema denticolа, Т. orale, Т. macrodenticum, Borrelia buccalis), микоплазмы, нокардии и др. К случайной микрофлоре полости рта относятся комменсалы, обитающие на других слизистых оболочках и коже, сапрофита внешней среды и различные патогенные микроорганизмы, которые попадают в полость рта в результате аэрогенного или алиментарного заражения от больных или бактерионосителей. Очень высокой способностью адаптироваться к существованию в ротовой полости обладают стафилококки, стрептококки, коринебактерии, грибы Candida, вирусы герпеса, эпидемического паротита и др.

Проведение анализа. Из зубного налета, смывов со слизистой оболочки зева готовят препараты-мазки, окрашивают их и микроскопируют. Из зубного налета также готовят препарат «раздавленная капля» для обнаружения подвижных микроорганизмов.

Для посевов берут определенный объем исследуемого материала (например, смыв из зева или зубной налет), разводят в стерильной воде (в зависимости от предполагаемой концентрации) и делают посевы из соответствующих разведений на питательные среды: для выявления стафилококка – на молочно-солевой и желточно-солевой агар; для выявления бактерий группы кишечной палочки – на среду Эндо; для выявления дрожжей рода Candida – на среду Сабуро. Ориентировочную идентификацию микроорганизмов проводят по характеру выросших колоний, морфологии клеток, окраске по Грамму.

Задание: описать микрофлору зубного налета, слизистой оболочки зева на основании данных микроскопического исследования; выделить и произвести количественный учет некоторых групп микроорганизмов из слизистой оболочки зева.

Материалы, оборудование.

Стерильные чашки Петри – 5 шт., стерильные пробирки; стерильные петли бактериологические; вата; микроскопы; стекла предметные и покровные, водопроводная стерильная; среды: Эндо, молочно-солевой или желточно-солевой, Сабуро, МПА, свежеприготовленный раствор диметил-n-фенилендиамина; свежее приготовленный 3%-й раствор КОН; реактивы для окраски по Граму; фуксин; 70% этанол.

Работа 15. Санитарно-бактериологическое исследование предметов

обихода рук персонала

Изучение бактериальной загрязненности рук и различных предметов обихода производится в целях оценки санитарно-гигиенического состояния исследуемого объекта, установления путей распространения инфекции при эпидемиологических заболеваниях, лабораторного контроля эффективности обработки кожи рук.

В зависимости от цели проводимого исследования и характера контролируемых объектов в полученных смывах определяют:

• общую микробную обсемененность (обычно с пересчетом на 1 см² исследуемой поверхности);

• наличие бактерий группы кишечной палочки, как показателей фекального загрязнения;

• наличие патогенных бактерий кишечной группы, обнаружение которых является безусловным показателем эпидемического неблагополучия;

• наличие стафилококков и других микроорганизмов.

Приготовление смывов. Для получения смывов пользуются стерильными ватными тампонами или марлевыми салфетками. В день взятия смыва в каждую пробирку с тампоном наливают 2 мл стерильной водопроводной воды или изотонического раствора хлорида натрия так, чтобы ватный тампон находился над уровнем жидкости. Марлевые салфетки 5x5 см заворачивают по одной бумагу. К каждой салфетке готовят заранее пробирку с 2 мл стерильной воды для смачивания. Непосредственно перед взятием смыва пробирку наклоняют, увлажняя находящийся в ней тампон. В случае применения салфеток их захватывают кончиком стерильного пинцета, прокаленного над пламенем горелки, и увлажняют стерильной водой из пробирки.

Увлажненный тампон или салфетку дают в руки обследуемому, предлагая протереть им сначала кожу левой, а затем правой руки (от участков с меньшей к участкам с большей загрязненностью): тыл кисти, поверхность ладони, межпальцевые пространства, ногтевые ложа. По окончании процедуры салфетки или тампоны помещают в пробирку, в которой они находились.

При взятии смывов с предметов, имеющих большую поверхность, исследуемый участок ограничивают рамкой-трафаретом площадью 25, 50 или 100 см. Трафарет, изготовленный из проволоки, после каждого смыва и перед употреблением прожигают над пламенем горелки. При исследовании мелких предметов смыв делают со всей поверхности.

Исследование смывов. Для определения общего числа микроорганизмов в исследуемом смыве к 2 мл воды, которая была использована для увлажнения тампона, прибавляют еще 8 мл стерильной воды. Тампон тщательно в течение 2-3 мин отмывают, получая исходное разведение. Из него готовят ряд последовательных десятикратных разведений. Затем из различных разведений смыва берут по 1 мл, вносят в стерильные чашки Петри, заливают расплавленным и остуженным МПА. Посевы выдерживают 24 ч. при 37°С и 24 ч. при комнатной температуре, после чего производят подсчет выросших колоний.

Устанавливают количество микроорганизмом и 1 мл исходного разведения смыва (для этого подсчитывают число колоний в чашке и полученную величину умножают на степень разведения смыва).

Определяют количество микроорганизмов и 10 мл смыва, соответствующее общему числу микроорганизмов, находящихся на той площади, с которой произведен смыв (для этого величину, соответствующую количеству микроорганизмов в 1 мл смыва, умножают на 10).

Определяют количество микроорганизмов на 1 см² исследуемой поверхности (для этого величину, характеризующую количество микроорганизмов в 1 мл смыва, делят на число квадратных сантиметров, с которых сделан смыв).

Для выявления бактерий группы кишечной палочки можно пользоваться прямым посевом исследуемого материала на чашки со средой Эндо. Материал, находящийся на тампоне, втирают в поверхность питательной среды Эндо. Кроме того, используют среды обогащения (среда Кесслера, КОДА и др.) – в этом случае тампон, снятый с палочки, помещают в соответствующую жидкую среду. Посевы на плотных средах инкубируют при 37°С, на жидких средах – при 43°С в течение 18-24 ч. На второй день из флаконов с признаками роста производят высев на чашки со средой Эндо. Дальнейший ход исследования полностью соответствует стандартной схеме выявления бактерий группы кишечной палочки.

Для выявления патогенных бактерий кишечной группы содержащийся на тампоне материал тщательно втирают в поверхность плотных питательных сред (висмут-сульфит агар и др.). После произведенного посева тампон и оставшуюся в пробирке жидкость-смыв помещают в среду обогащения (селенитовый бульон). Через 24-48 ч инкубации при 37°С просматривают посевы, сделанные на плотные среды, выявляя колонии, характерные для патогенных бактерий кишечной группы. Идентификация выделенных микроорганизмов с бактериями группы сальмонелл производится по методам, изложенным выше.

Для выявления стафилококка производят посев 0.5-1 мл смыва на молочно-солевой или желточно-солевой агар и в среду накопления (солевой бульон – МПБ, содержащий 6,5% NaCl). Колонии с признаками, характерными для стафилококков, изучают, как описано выше.

Задание: определить степень микробной загрязненности кожи предметов обихода.

Материалы и оборудование.

Стерильные чашки Петри; стерильные пробирки; стерильные пипетки; стерильные ватные тампоны или марлевые салфетки; палочки стеклянные; пинцеты; петли бактериологические; вата; микроскопы; стекла предметные и покровные. Вода водопроводная стерильная; среды: Эндо, Кесслера или КОДА, МПА, полужидкая с глюкозой, молочно-солевой или желточно-солевой агар, солевой бульон, висмут-сульфит агар, селенитовый бульон, свежеприготовленный раствор диметил-n-фенилендиамина; свежеприго-товленный 3%-й раствор КОН; реактивы для окраски по Граму; фуксин; 70%-й этанол.

Работа 16. Исследование микрофлоры воздуха

Дата добавления: 2015-02-05 | Просмотры: 4013 | Нарушение авторских прав