АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Использование реакции элементов крови для диагностики аллергии

В литературе, посвященной общим вопросам аллергии и патогенеза аллергического процесса, большое место уделяется роли клеточных элементов крови в аллергических реакциях. Клетки крови могут быть носителями антител (лимфоциты), мо­гут фиксировать на себе комплекс антиген—антитело (тромбоци­ты, эритроциты, зернистые лейкоциты, базофилы). На этих свойствах клеток крови основаны некоторые методы лабораторной диагностики.

Тест дегрануляции базофильных лейкоцитов. В ряде работ убедительно показано, что базофилы крови и тканевые тучные клетки, участвуя в аллергических реакциях преимущественно не­медленного (химергического) типа, подвергаются альтерации, дегрануляции и даже лизису, что сопровождается выделением биологически активных веществ. Shelley в 1962 г. предложен диа­гностический тест, основанный на изменении формы базофилов в присутствии комплекса антиген—антитело, который впоследствии получил название теста Шелли.

Существует прямая и непрямая реакция. Прямая реакция ставит­ся на базофильпых лейкоцитах больного аллергией. Однако этот метод тре­бует большого количества крови больного, так как базофилов в крови чело­века немного (0,3—0,4%). Предварительно проводится лейкоконцентрапия.

В детской практике диагностика пищевой аллергии производится с по­мощью непрямого теста Шелли. В крови кроликов много базофи­лов (4—12%). Непрямой тест ставится па изолированных базофилах ин-тактных кроликов. Кровь с гепарином, взятая из ушной вены кролика, центрифугируется в узких пробирках в течение 5 мин при 3000 об/мпп. За­тем отсасывают беловатую лейкоцитарную пленку между плазмой и эритро-питной взвесью. Предварительно на предметное стекло наносят каплю 0,3% спиртового раствора нейтрального красного. На подсохший краситель по­мещают каплю (0,05 мл) сыворотки больного, каплю базофильной (кроличья) пленки п каплю аллергена. Параллельно ставят контроль с аллергеном без сыворотки больного и с сывороткой, но беа аллергена. Предметное стекло после осторожного помешивания смеси накрывают покровным и подсчиты­вают базофилы. О результатах реакции судят по числу дегранулированных базофилов (под микроскопом при увеличении 600). Просматривают 20 или 40 клеток в различных полях зрения. Учитывается процент измененных ба­зофилов. Основным критерием теста Шелли являются изменения формы клеток (грушевидные, вытянутые, с псевдоподиями). В цитоплазме базо­филов определяются вакуоли, а вокруг клеток — гранулы. Показатель бо­лее 10—15% считается положительным результатом. Процент дегранулиро­ванных базофилов в контроле не должен превышать 2—3. А. А. Полънер выделяет 3 стадии реакции Шелли: латентный период (10—15 мин), период активации (15—20 мин), возвращение клетки в состояние относительного покоя.

При явной повышенной чувствительности к тому или иному аллергену тест иногда бывает отрицательным, что связано с раз­ведением аллергена, причем это не всегда максимальные концен­трации. Иногда тест бывает положительным при очень низких концентрациях аллергена, а при высоких не происходит деструк­ции базофилов.

Дегрануляция тучных клеток соединительной ткани. При вы­полнении теста Шелли приходится сталкиваться с рядом трудно­стей: получение хорошей лейкоцитарной пленки, взятие крови у одного и того же кролика не чаще 1 раза в неделю, нестойкость и склонность базофилов к спонтанной деструкции. В связи с этим в последнее время все шире используют тучные клетки крысы.

Методика. Необходимо получить взвесь тучных, клеток. Интактную крысу обезглавливают. Внутрибрюшинно вводят 5—7 мл изотонического ра­створа хлорида натрия или раствора Тироде, подогретого до 37 "С, Брюшко слегка массируют в течении 15 мии. Затем брюшную полость вскрывают, ее содержимое стекает в пробирку, нагретую до 37 °С и смоченную гепарином. Полученную взвесь, содержащую тучные клетки, необходимо держать в тер­мостате при 37 °С все время исследования.

До начала опыта, который ставится аналогично тесту Шелли, необхо­димо просмотреть один препарат (взвесь тучных клеток, нанесенную на предварительно окрашенное нейтральным красным предметное стекло). Ес­ли в препарате много спонтанно дегранулированных тучных клеток, то туч­ные клетки этой крысы использовать в опыте нельзя.

Результаты теста определяют так же, как и предыдущего (тест Шелли), по проценту измененных тучных клеток, но просматривают больше клеток (50—100). Положительным считается результат больше 10% без де­струкции в контроле (0—3%).

Тест торможения прямой дегрануляции тучных клеток ставит­ся с тучными клетками предварительно сенсибилизированной крысы. В реакции участвуют сенсибилизированные тучные клетки перитонеальной жидкости крыс, исследуемая сыворотка и аллер­ген.

Взвесь сенсибилизированных тучных клеток наносят на заранее окра­шенное предметное стекло (нейтральный красный), добавляют каплю (0,05 мл) аллергена. Получается прямой тест дегрануляции тучных клеток. Ре­зультаты реакции читают через 10—15 мин пребывания препарата в термо­стате. Подсчитывают процент дегранулированных клеток. Далее на каждое предметное стекло серии наносят одно разведение исследуемой сыворотки, каплю аллергена и каплю сенсибилизированных тучных клеток крысы и так же подсчитывают процент деграпулированных клеток. Результаты срав­нивают с данными прямого теста. За титр принимают разведение сыворотки больного, способное тормозить дегрануляцию тучных клеток сенсибилизи­рованного животного.

Показатель повреждения нейтрофилов (тест ППН по Фрадки­ну). Первоначально этот тест был предложен В. А. Фрадкиным (1962) для диагностики туберкулиновой аллергии, но позднее ряд исследователей с успехом использовали его для диагностики как инфекционной, так и неинфекционной аллергии.

На высокую корреляцию показателей кожных проб и теста ППН указывают данные, полученные нашей сотрудницей с аллер­генами грибов [Яблокова Ф. М., 1983].

Сущность метода состоит в усилении амебоидной активности нейтрофилов крови сенсибилизированных лиц при контакте со специфическим аллергеном. В настоящее время выпускают ряд инфекционных аллергенов-диагностикумов специально для теста ППН.

Методика. В две химически чистые пробирки вносят по 0,02 мл 5% раствора цитрата натрия (контроль) и 0,02 мл аллергена с цитратом. Для каждой опытной и контрольной пробирки набирают микропипеткой по 0,08 мл крови из пальца. Пробирки осторожно встряхивают (для перемешива­ния) и ставят в термостат на 2 ч при 38 °С. Готовят мазки, которые обра­батывают па гликоген. Мазки фиксируют 96% спиртом в течение 10 мин. Перед использованием к спирту добавляют 40% раствор нейтрального фор­малина (на каждые 10 мл спирта 1 мл формалина).

Лабораторная диагностика включает также реакцию бластной трансформации лейкоцитов (БТЛ), тест розеткообразующих клеток (РОК), которые можно использовать в диагностике лекарст венной, бактериальной и грибковой аллергии.

Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) ис­пользуется в клинической диагностике с 60-х годов. Феномен основан на трансформации лимфоцитов в бласты при контакте с аллергеном. Лимфоциты увеличиваются в размерах, в них усили­вается синтез РНК и ДНК, белка, появляются митозы. В педиат­рической практике пользуются модификацией РБТЛ, связанной с накоплением лимфоцитов. Для выявления повышенной специ­фической чувствительности нужен как можно более очищенный аллерген, чтобы избежать неспецифического влияния примесей. Обычно РБТЛ ставят с антигенами простейших, грибов, бактерий, вирусов, а также используют при медикаментозной аллергии.

При постановке реакции необходимо брать несколько разведе­нии аллергена, так как прп низких или высоких концентрациях можно получить извращенные данные.

Для правильной оценки результатов РБТЛ параллельно с ал­лергеном ставят реакции на неспецпфический митоген — ФГА и с разводящей жидкостью.

Результаты специфической и неспецифической РБТЛ могут дополнять друг друга. Очень важна стандартизация условий куль­тивирования клеток.

Дата добавления: 2015-09-18 | Просмотры: 668 | Нарушение авторских прав