АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Тема: Тонкослойная хроматография (экстракция, очистка экстрактов, концентрирование экстрактов)

Цель занятия: Изучить основные этапы тонкослойной хроматографии.

В основе метода лежит разделение ядовитых веществ (хроматография), выполняемое на слое адсорбента, который нанесен на подложку (стеклянную пластинку). Это один из простых, достаточно чувствительных и доступных для практических лабораторий методов. К тому же он не требует дорогостоящих, сложных приборов и дает возможность производить качественное и количественное определение многих пестицидов, ядов растительного и микробного происхождения.

Основные этапы тонкослойной хроматографии включают экстракцию (извлечение) ядовитых веществ из корма и патматериала, очистку экстрактов от посторонних примесей, концентрирование их, разделение на пластинке, проявление и количественное определение.

Экстракция – это процесс переноса растворенного вещества из одной жидкой фазы в другую (несмешивающуюся с ней). В качестве экстрагирующего растворителя берут обычно органические вещества, в которых хорошо растворяется яд. Например, для экстракции ХОС используют ацетон, н-гексан, петролейный эфир, бензол, хлороформ или их смеси; для ФОС – спирты, хлороформ, этилацетат.

Берут навеску измельченного объекта заливают растворителем и проводят экстракцию в аппарате Соксклета, при помощи смесителей, в шуттель-аппарате или путем простого настаивания в течение 12-14 ч.

Очистку экстрактов проводят методом омыления, сульфинирования, распределения между двумя несмешивающимися жидкостями, осаждения жиров, восков и белков, колоночной хроматографии. Точность исследования зависит от правильно подобранного в каждом конкретном случае метода очистки экстрактов.

Омыление применяют при определении устойчивых к щелочному гидролизу препаратов. Например, нельзя омылять ГХЦГ, ДДТ, производные мочевины, некоторые ФОС.

Сульфинирование осуществляется в делительной воронке, где н-гексановый экстракт осторожно встряхивают с концентрированной серной кислотой или насыщенным раствором безводного сульфата натрия в концентрированной серной кислоте. Органический слой обрабатывают до тех пор пока раствор сульфата натрия в серной кислоте не будет бесцветным.

Метод распределения между двумя несмешивающимися жидкостями основан на различии коэффициентов распределения ядовитых веществ и сопутствующих веществ между двумя несмешивающимися растворителями. С этой целью обычно берут н-гексан и диметилформамид или ацетонитрил.

Осаждение жиров и восков основано на плохой их растворимости в холодном ацетоне, для чего экстракт вымораживают в холодильнике или в приготовленных охлажденных смесях со льда и различных солей (хлорида натрия, сульфата и карбоната натрия, нитрата аммония и натрия).

Осаждение белков осуществляют коагулирующей смесью, состоящей из 5 г аммония, 10 мл 85%-ного раствора ортофосфорной кислоты и до 1 л дистиллированной воды.

Колоночная хроматография проводится при помощи стеклянных колонок, заполненных силикагелем или диоксидом кремния.

Концентрирование экстрактов осуществляют при помощи вакуум-ротационного испарителя, испарение с капилляром под вакуумом на водяной бане. Самые низкие потери препаратов бывают при использовании ротационного испарителя. В остальных случаях необходимо руководствоваться требованием: не повышать температуру водяной бани свыше 40⁰С и не упаривать досуха очищенные экстракты.

Разделение ядовитых веществ, содержащихся в концентрированном экстракте, проводят на пластинках с тонким слоем сорбента в хроматографических камерах с подвижным растворителем.

С этой целью можно использовать готовые пластинки отечественного и зарубежного производства.

Стеклянные пластинки размером 9 Х 12, 13 Х 18, 20 Х20 см тщательно моют раствором кальцинированной соды, затем хромовой смесью, водопроводной и дистиллированной водой, сушат в вертикальном положении. Перед нанесением сорбционного слоя обрабатывают спиртом и эфиром

Сорбционную массу готовят из силикагеля или окиси алюминия, которые закрепляют на пластинках крахмалом или гипсом.

Подготовка силикагеля. Очищенныйот примесей силикагель м заливают на 18-20 ч разведенной (1:1) соляной кислотой, после сливания которой силикагель промывают водой и кипятят 2-3 ч в разбавленной (1:1) азотной кислоте. После промывания водопроводной, затем дистиллированной водой до нейтральной реакции силикагель сушат при 130 ⁰ С в течении 4-6 ч., дробят на шаровой мельнице, просеивают через сито 100 меш (1600 отверстий на 1см² ) и хранят в склянке с притертой пробкой.

Подготовка гипса. Гипс (Ca SO_4. 2Н₂ О) прокаливают в сушильном шкафу при 160⁰ в течении 6 ч, растирают в ступке и просеивают через сито 100 меш.

Приготовление сорбционной массы:

1 Силикагель с крахмалом. На 15 пластинок (9Х12 см) берут 40 г силикагеля марки ШСК или КСК-2, 1 г растворимого крахмала и 125 мл воды; 40 г силикагеля марки КСС-3, 1,5 крахмала и 110 мл воды. Крахмал заваривают в 15 мл воды, доливают остальную воду, засыпают силикагель и хорошо перемешивают.

2 Силикагель с гипсом. На 10 пластинок (9Х12 см) 35 г силикагеля КСК и 2 г гипса растирают в фарфоровой ступке, прибавляют 90 мл воды и размешивают до однородной массы.

3 Оксид алюминия с гипсом. На 10 пластинок (9Х12 см) 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш, и 5 г гипса тщательно смешивают в фарфоровой ступке, переносят в колбу, добавляют 75 мл воды и встряхивают до образования однородной массы.

Для получения слоя сорбента стандартной толщины используют специальные приборы или берут две чайные ложки сорбционной массы, наносят на пластинку (9Х12 см) и покачиванием равномерно распределяют по поверхности. Пластинки сушат при комнатной температуре и хранят в эксикаторе.

В качестве хроматографических камер используют стеклянные сосуды с плотно закрывающейся крышкой или эксикаторы, на дно которых наливают подобранный для каждого ядовитого вещества подвижный растворитель (например, для разделения ХОС берут н-гексан, петролейный эфир, бензол, гептан и их смеси; для ФОС – хлороформ, гексан, ацетон и их смеси).

Для обнаружения пятен ядовитых веществ на хроматограммах готовят проявляющие реактивы, которые образуют с ними цветные комплексы. Обычно пластинки опрыскивают раствором реагента при помощи стеклянного пульвизатора.

Ход анализа. На стартовую линию пластинки (1,5 см от края) наносят в виде точек анализируемые пробы и известные количества стандартных растворов предполагаемых ядовитых веществ при помощи шприца на 1 мл, микропипетки или специального микрометрического шприца. Размер пятна на слое сорбента в диаметре не должен превышать 1 см.

За 1 ч до анализа в хроматографическую камеру заливают подвижный растворитель, уровень которого не должен превышать 0,5 см. помещают пластинки в растворитель и закрывают плотно камеру. После поднятия растворителя по сорбенту на высоту 10 см пластинки вынимают, отмечают верхнюю границу подъема растворителя (линию фронта), высушивают на воздухе и обрабатывают проявляющим реагентом.

Качественная идентификация ядовитых веществ проводится по величине Rf (отношение расстояния от линия стандарта до центра пятна к расстоянию от линии стандарта до линии фронта), которая для каждого яда постоянна. Количественный анализ основан на измерении площадей пятен исследуемого вещества и известного количества стандартного вещества.

Контрольные вопросы:

1 Как проводят разделения ядовитых веществ?

2 Основные этапы тонкослойной хроматографии?

Дата добавления: 2015-02-06 | Просмотры: 2068 | Нарушение авторских прав