АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

НА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ДИАРЕЙНЫХ ИНФЕКЦИИ

П е р в ы й э т а п: подготовка материалов к исследованию и посев его на питательные среды.

Испражнения, доставленные в нативном виде, разводят 1: 10 стериль­ным 0,85 % раствором натрия хлорида или стерильной 0,1 % пептонной водой. Через 10 - 15 мин засевают 1 - 2 капли взвеси на плотные питательные среды и 1 мл в пробирку со средой обогащения (соотношение 1: 5). Испражнения, доставленные в транс­портной среде, засевают без разведения. Посев испражнений произво­дят:

1) при кишечных заболеваниях неясной этиологии и обследованиях на бактерионосительство патогенных энтеробактерий - в чашки с бактоагаром Плоскирева, средой Эндо (или агаром с эозин-метиленовым синим Ле­вина) и в селенитовую среду обогащения (или среды магниевую, Мюллера, Кауфмана) с высевом из нее через 10 - 18 ч на висмут-сульфитный агар и бактоагар Плоскирева (высев со сред магниевой, Мюллера, Кауфмана че­рез 18 ч);

при групповых диарейных заболеваниях дополнительно с целью коли­чественного определения условно патогенных энтеробактерий - в чашки со средой Эндо и бактоагаром Плоскирева по 0,1 мл из разведений ис­пражнений 10^-3 и 10^-5 (разведения проводить стерильным 0,85 % раство­ром натрия хлорида);

2) при подозрении на кампилобактериоз фекалии засевают на поверхность селективных питательных сред без антибиотиков; в первом варианте 0,1 мл эмульсии фекалий засевают петлей или шпателем на поверхность железо-эритрит-кровяного агара (ЖЭКА) или селективного эритрит-агара; во втором варианте используют мембранные или ядерные фильтры, уложенные на поверхность среды ЖЭКА без антибиотиков или питательной среды на основе эритрит-агара с бактериологическим углем без антибиотиков; при этом на мембранные фильтры “Владипор” (№ 6 с диаметром пор 0,55 - 0,65 мкм), уложенных по три на чашку (для посева 3 образцов) наносят пипеткой 4 - 5 капель эмульсии фекалий и после экспозиции 30 минут при 37 ^ОС фильтры удаляют с поверхности среды; при использовании ядерных фильтров (с диаметром пор 0,45 - 0,55 мкм), уложенных по 2 на чашку (0,45 и 0,55 мкм, для посева одного образца), наносят на фильтр 1 каплю эмульсии фекалий и после экспозиции 15 - 20 минут при комнатной температуре удаляют фильтры с поверхности Среды, а чашки с посевами инкубируют;

3) при подозрении на холеру, на заболевания, вызванные другими хо­лерными вибрионами (серогруппы “не 01”), обследованиях на вибрионоси-тельство - в чашку со щелочным агаром и флакон с 50 - 100 мл 1 % ще­лочной пептонной воды (0,5 - 3 г испражнений; материал, доставленный в 5 мл 1 % щелочной пептонной воды используется для высева пол­ностью);

4) при известчой этиологии заболеваний и целенаправленных исследо­ваниях на их возбудителей:

- у больных дизентерией, реконвалесцентов и переболевших - в чаш­ки с бактоагаром Плоскирева и агаром с эозин-метиленовым синим (одну из указанных средможно применять с антибиотиками); при массовых обследованиях в эпидемических очагах дизентерии с антибиотикоустойчивыми возбудителями - на бактоагар Плоскирева с антибиотиком:

- у больных сальмонеллезом, реконвалесцентов и переболевших - в чашку с бактоагаром Плоскирева (или агаром с эозин-метиленовым си­ним) и селенитовую среду обогащения (или среды магниевую, Мюллера, Кауфмана) с последующим высевом из нее в чашку с висмут-сульфитным агаром или бактоагаром Плоскирева;

- у больных кишечным иерсиниозом или псевдотуберкулезом - на среды Серова, Эндо и фосфатно-буферную (рН 7,4 - 7,6) среду обогащения с последующим высевом из нее в чашку со средой Серова или Эндо;

- у больных и переболевших эшерихиозом - в чашку со средой Эндо;

- при заболеваниях, вызванных условно патогенными энтеробактериями, - в чашки со средой Эндо и бактоагаром Плоскирева;

- при заболеваниях, вызванных холерными вибрионами, - в чашку со щелочным агаром и в пробирку с 1 % щелочной пептонной водой.

- при заболеваниях, вызванных кампилобактерами, посевы материала проводят по методике пункта 2.

При групповых заболеваниях пищевыми токсикоинфекциями исследо­вания испражнений и других материалов на энтеробактерий, стафилокок­ки, энтерококки, псевдомонас, галофильные вибрионы, клостридии перфрингенс, бациллюс цереус проводятся в соответствии с рекомендациями методического пособия “Лабораторная диагностика в войсковом звене медицинской службы. Часть 2. Микробиологические и паразитологические исследования” (Воениздат, 1985) и “Методических рекомендаций по проведению бактериологических исследований при пищевых отравлениях” (М., Минздрав РФ, 1990).

Рвотные массы и промывные воды желудка засевают на питательные среды так же, как испражнения.

Желчь (дуоденальное содержимое) и мочу исследуют при обследова­ниях на бактерионосительство сальмонелл. Каждую порцию желчи (А, В, С) или их смесь засевают по 0,3 - 0,5 мл на чашки с бактоагаром Плоскирева (или агаром с эозин-метиленовым синим) и по 1 - 2 мл в пробирки со средой обогащения (селени­товой). Оставшаяся желчь инкубируется в нативном виде. Осадок мочи после центрифугирования сеют на те же сре­ды, что и испражнения. Цельную мочу можно засеять в равный объем (10 - 20 мл) селенитовой среды двойной концентрации.

Кровь исследуют при подозрении на сальмонеллез и тифопаратифозное заболевание. Ее целесообразно засевать у постели больного в пита­тельную среду в соотношении 1: 10 (10 мл крови во флакон с 100 мл сре­ды Рапопорта или 10 - 20 % желчного бульона). При взятии крови в про­бирку отделяют сыворотку от сгустка, сыворотку используют для сероло­гических реакций, сгусток крови измельчают стеклянной палочкой и засе­вают подобно посеву цельной крови.

Секционный материал (кусочки печени, селезенки, кишечника, костного мозга, мезентериальных лимфоузлов) тщательно измельчают в ступке с добавлением стерильного песка и стерильного 0,85 % раствора натрия хло­рида. После отстаивания надосадочную жидкость засевают на питатель­ные среды. Посев крови и содержимого кишечника производят отдельно. Используют питательные среды, применяемые для посева испражнений и крови.

Среды с антибиотиками используют в зависимости от распространен­ности антибиотикоустойчивых шигелл на данной территории. При наличии среди местных штаммов не менее 40 - 50 % устойчивых к левомицетину ре­комендуется применять бактоагар Плоскнрева с левомицетином (25 мкг на 1 мл среды).

При широком распространении штаммов, устойчивых к тетрациклину (более 50%), целесообразно использовать бактоагар Плоскирева, содержа­щий тетрациклина гидрохлорид (10 ЕД на 1 мл среды) и альбуцид натрия (30 мкг на 1 мл Среды). Среды с антибиотиками особенно эффективны при обследовании больных дизентерией в поздний период болезни.

Каждая используемая серия питательных сред должна быть предвари­тельно проверена в лаборатории с музейными или свежевыделенными штаммами шигелл, сальмонелл, эшерихий и других бактерий по методике изложенной в Приложении №5. Биологический контроль сред для выделения холерных вибрионов проводится в отделах особо опасных инфекций СЭО или в соответствующих лабораториях Министерства здравоохранения РФ.

Посевы на плотных средах выращивают при температуре 37°С в тече­ние 18 - 24 ч; на висмут-сульфитном arape, средах Серова, Эндо (при по­севе на иерсинии) - 24 - 48 ч. Высевы со сред обогащения (магниевой, Мюллера) на плотные среды проводят через 18 ч, из селенитовой среды - через 10 - 18 ч. Нативную желчь инкубируют при температуре 37⁰С 7 сут с высевом на среду Эндо на 3, 5, 7 сут. Посевы крови выращивают при температуре 37⁰С, через 20 - 24 ч производят первый высев в чашки со сре­дой Эндо и при отрицательном результате повторяют высев на 3, 4, 6, 10 сут. Посевы на иерсинии на фосфатно-буферной среде обогащения вы­ращивают в холодильнике при температуре от 3 до 5⁰С и делают высевы из нее на среду Серова (или Эндо) через 2, 5, 10, 20 дней. Посевы на хо­лерные вибрионы инкубируются при температуре 37⁰С в 1 % щелочной пептонной воде 6 - 8 ч, на щелочном агаре - 14 - 16 ч и подвергаются даль­нейшему исследованию в соответствии с Инструкцией по организации и проведению противохолерных мероприятий (М., Минздрав РФ, 1996).

Посевы на кампилобактеры инкубируют в микроаэрофильных условиях. Эти условия можно создать различными методами. Наиболее доступны, но менее эффективны: сжигание свечи внутри стеклянного эксикатора с притертой крышкой или герметичного сборника твердых отходов РВ СТО-10. Более эффективно сжигание свечи внутри микроанаэростата № 4 (модель 752) при одновременном откачивании воздуха до "- 0,8 атм" по манометру. Возможно использование специальных полимерных пакетов с генератором углекислого газа и поглощения кислорода. Лучшие результаты дает использование газовой смеси заводского изготовления (5 % кислорода, 10 % углекислого газа, 85 % азота). Этой газовой смесью заполняется пространство анаэростата или вакуумного термостата, откуда предварительно откачали воздух до отметки манометра “- 0,9 атм” - “1,0 атм”. Газовая смесь подается под давлением до отметки “0” шкалы манометра. Процедура откачивания воздуха и заполнения газовой смесью повторяется дважды. Чашки с посевами помещают в микроанаэростат и вакуумный термостат крышкой вверх. Посевы на средах с антибиотиками инкубируют при 42 ^ОС, на средах с фильтрами - при 37 ^ОС. Посевы выращивают в течение 72 часов с ежесуточным просмотром чашек и последующим воссозданием микроаэрофильных условий.

В т о р о й э т а п: изучение колоний на плотных питательных средах первичного посева, отсев бактерий из подозрительных колоний, высев со сред обогащения на плотные питательные среды.

Колонии на питательных средах изучают через 18 - 24 ч после посева. Шигеллы и сальмонеллы формируют на средах Эндо, Плоскирева, Левина колонии диаметром 1 - 4 мм, бесцветные, прозрачные или полупрозрачные, круглые, выпуклые, с ровным краем (S-форма) или плоские колонии с за­зубренным краем (R-форма), что особенно характерно для шигелл Зонне. На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных колоний-с металлическим блеском, и среда под ними окрашивается в черный цвет. Исключение составляют S. paratyphi А и ряд сальмонелл группы С, обра­зующие зеленоватые колонии. Посевы на этой среде следует дополнитель­но просматривать еще через 24 ч. Энтеропатогенные эшерихии (ЭПКП) формируют на среде Эндо и бактоагаре Плоскирева крупные (3 - 5 мм), выпуклые, мутные, сочные, окрашенные в красный цвет колонии, в то вре­мя как энтероинвазивные эшерихии (ЭИКП) и энтеротоксигенные эшерихии (ЭТКП) образуют неокрашенные колонии, подобные колониям ши­гелл, однако более крупные. Вместе с тем нередко встречаются варианты эшерихии групп ЭИКП и ЭТКП, образующие окрашенные лактозопозитивные колонии. Колонии иерсиний на среде Эндо, бактоагаре Плоскирева (иерсиния псевдотуберкулеза на этой среде не растет) подобны шигеллам, однако более мелкие (0,6 - 1 мм) и достигают размеров колоний шигелл через 48 ч. На среде Серова колонии иерсиний имеют форму многогранни­ков с сосцевидным центром.

На плотных питательных средах с кровью кампилобактеры образуют два типа колоний, первому из которых свойственна плоская округлая форма, 2 - 8 мм в диаметре, ровные края, прозрачность, бесцветность; колонии вторго типа имеют правильную округлую форму, 1 - 2 мм в диаметре, ровные края, блестящую гладкую поверхность, прозрачные, бесцветные, гемолиз не вызывают, консистенция невязкая. На плотных средах с бактериологическим углем колонии плоские, округлые, диаметр 1 - 3 мм, полупрозрачные, белые, блестящие, невязкой консистенции.

Колонии, подозрительные на принадлежность к шигеллам, сальмонел-лам, иерсиниям и лактозонегативным энтеропатогенным эшерихиям, пере­севают в пробирку со средой Олькеницкого без сахарозы (вместо среды Олькеницкого можно использовать пробирки со средой Клиглера и средой Кристенсена с мочевиной). При использовании ускоренной биохимической идентификации микрометодом дополнительно засевают часть каждой ко­лонии густым штрихом на сектор желчного агара (одну шестую часть чаш­ки Петри).

Для отбора колоний, подозрительных на лактозопозитивные энтеропа­тогенные эшерихии, производят агглютинацию на стекле с адсорбирован­ной эшерихиозной поливалентной ОКА-сывороткой, содержащей антитела к эшерихиям наиболее распространенных серогрупп. При целенаправленном поиске колоний энтерогеморрагических кишечных палочек (ЭГКП) используют для обора колоний реакцию агглютинации на стекле с ОК сыворотками серогрупп 0157, 026, О103, О145. При росте однотип­ных колоний изучают не менее 10 колоний, при росте колоний разных ви­дов испытывают все их виды. Колонии, давшие положительную реакцию-агглютинации, высевают на среду Олькеницкого и сектор желчного пита­тельного агара при использовании метода микрокультур для ускоренной идентификации. Неагглютинирующиеся лактозопозптивные колонии пере­севают для дальнейшего изучения только при отсутствии лактозонегативных колоний. При групповых диарейных заболеваниях неизвестной этиоло­гии отсевают для изучения не только колонии, подозрительные на принад­лежность к патогенным энтеробактериям, но и прочие лактозопознтивные И лактозонегативные колонии, учитывая их количество на питательных сре­дах.

Колонии, подозрительные на кампилобактеры, изучают визуально или с помощью стереоскопического микроскопа. Из изолированных типичных колоний делают мазки, окрашивают 1 % раствором фуксина или кристаллического фиолетового. При наличии типичной морфологии: спирально изогнутых по оси клеток 0,5 - 0,8 мкм шириной и 0,2 - 0,5 мкм, одиночных или парных в виде “крыльев чайки” или кокковидных и гиперспирализованных форм в старых культурах пересевают материал колоний на поверхность такой же Среды. Посевы инкубируют при 42 ^ОС 48 часов в микроаэрофильных условиях, а культуры, полученные методом фильтров, инкубируют при 37 ^ОС.

Через 10 - 18 ч после первичного посева делают высевы на плотные питательные среды со сред обогащения. При исследовании крови делают пересев со среды Рапопорта на среду Эндо.

Т р е т и й э т а п: изучение чистых культур бактерий и посевов со сред обогащения, постановка тестов биохимической идентификации, завершение идентификации при использовании ускоренного метода микрокультур в планшетах и выдача ответа; проведение при необходимости дополнительных исследований.

Основой идентификации энтеробактерий является изучение их биохимических свойств. Биохимическая идентификация энтеробактерий проводится по микрообъемной технологии методом микрокультур. Только при отсутствии возможности использования этой методики применяют традиционный пробирочный метод идентификации.

Предварительно определяют принадлежность бактерий к семейству энтеробактерий тестами: на цитохромоксидазу с 1 % водным раствором диметилпарафенилендиамина; окраской по Граму или тестом тяжа с 3 % КОН; ферментацию глюкозы на среде Олькеницкого или микрообъемным методом за 1 ч. Дальнейшей идентификации подлежат культуры грамотрицательных, оксидазонегативных, ферментирующих глюкозу бактерий.

Пробирочным методом изучают культуры со среды Олькеницкого (без сахарозы) или со среды Клиглера и Кристенсена (с мочевиной). В зависимости от варианта результатов тестов на ферментацию глюкозы, мочевины и образования сероводорода на этих средах выбирают необходимый комплекс тестов для дальнейшей биохимической идентификации культуры в соответствии с таблицей № 2. Используют в нужном сочетании следующие тесты: на образование ацетоина (на среде Кларка), образование индола (на бульоне Хоттингера или 1 % пептонной воде); наличие триптофандезаминазы, лизиндекарбоксилазы; рост на среде Симмонса, ацетатной среде; ферментацию лактозы, сахарозы, маннита, сорбита, арабинозы, рамнозы (на жидких или полужидких средах Гисса); подвижность (в 0,3 % питательном агаре). При нечетких результатах гидролиза мочевины на среде Олькеницкого этот тест повторяют на среде с мочевиной Кристенсена или Преуса. Посевы инкубируют при 37 ^ОС в течение 18 - 24 часов.

Для исследования методом микрокультур целесообразно использовать способ ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий в планшетах с жидкими средами. Комплект сред и реактивов для этого способа можно изготовить непосредственно в лаборатории или использовать коммерческий комплект “Рапид-энтеро” (производства НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург). Способ экономичен и быстр (5 - 6 часов). Можно использовать и другие коммерческие тест-системы биохимической идентификации энтеробактерий со сроками исследования 18 - 24 часа (ПБДЕ, НИИЭМ, Нижний Новгород; ММТ Е1 и Е2, НПО “Аллерген”, Ставрополь; Enterotest I и II, Lachema,Чехия и др.).

При исследовании ускоренным методом микрокультур с жидкими средами используют посевы на желчном агаре. Посевы на среде Олькеницкого служат для ориентировки при исследованиях на патогенные энтеробактерии: дальнейшему изучению с желчного агара подлежат культуры, ферментирующие глюкозу, мочевину, а также лактозопозитивные культуры, которые предварительно агглютинировались эшерихиозной поливалентной ОКА-сывороткой и сыворотками к ЭГКП. При исследованиях на условно-патогенные энтеробактерии изучают все культуры с секторов желчной среды независимо от их характеристики на среде Олькеницкого. Используют отечественные полистироловые планшеты для иммунологических реакций однократного применения. Стерильный планшет с крышкой заключен в герметичную упаковку, имеет 96 лунок объемом 0,2 мл (8 горизонтальных рядов по 12 лунок). Планшеты используют однократно, однако возможно многократное повторное использование после дезинфекции и мытья (например, замачивание в 3 % растворе перекиси водорода в течение 24 часов, промывание водой).

Дифференциальные среды вносят в планшеты стерильными пипетками в день исследования по 0,1 мл в лунку. Среды для одной культуры размещают в одном горизонтальном ряду лунок, желательно в постоянной последовательности: на уреазу, триптофандезаминазу, индол, лизиндекарбоксилазу, ацетоин, сероводород; ферментацию лактозы, сахарозы, маннита, сорбита, арабинозы, адонита. Количество планшетов со средами соответствует количеству предполагаемых анализов. Суточную агаровую культуру изучаемых бактерий вносят по полной петле в каждую лунку со средой и тщательно размешивают. Петлю прожигают только в начале и в конце посева на весь ряд. На поверхность сред с мочевиной и лизином наносят после посева бактерий по 2 капли стерильного вазелинового масла. В один горизонтальный ряд сред культуры не вносят (контроль сред). Планшеты закрывают крышками и инкубируют при 37 ^ОС. Предварительный учет результатов на среде с мочевиной проводят через 2 минуты и 1 час, на среде с лизином - через 2 часа. Через 4 часа добавляют реактивы на ацетоин в лунку со средой Кларка: 0,05 мл 6 % спиртового раствора альфа-нафтола и 0,05 мл 40 % раствора КОН и вновь помещают планшет в термостат на 1 час. Итак, через 5 часов после посева окончательно учитывают результаты: наличие уреазы - по переходу исходной желтой окраски в малиновую; наличие триптофандезаминазы - по появлению темно-коричневого или красно-бурого окрашивания среды через 1 - 2 минуты после внесения одной капли реактива с хлорным железом; образование индола - по появлению красного кольца на поверхности среды через 1 - 2 минуты после внесения одной капли реактива Ковача; наличие лизиндекарбоксилазы - по изменению желтого цвета среды в зеленый или синий; образование сероводорода - по появлению черного осадка на дне лунки; ферментацию углеводов и спиртов - по переходу исходного цвета среды в желтый; появление красного или розового окрашивания среды Кларка указывает на наличие ацетоина. Идентификацию энтеробактерий проводят по схеме, представленной в таблице №1 Приложения №4.

Условно-патоненные энтеробактерии окончательно идентифицируются до вида (рода) по результатам оценки биохимической активности. При затруднениях в дифференциации энтеропатогенных эшерихий и шигелл целесообразно использовать дополнительно микрообъемные тесты на ферментацию цитрата и ацетата (на буферной основе рН - 7,); учет через 18 часов). Бактерии родов шигелла, сальмонелла и Е. сoli подвергаются серологической идентификации. Шигеллы и сальмонеллы изучаются в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными сыворотками с целью установления их вида и серовара. Культуры эшерихий исследуют в реакции агглютинации с поливалентной ОКА-сывороткой, при ее положительном результате - с поливалентными сыворотками ОКВ, ОКС, ОКД, ОКЕ. При агглютинации с одной из поливалентных сывороток ставят реакцию агглютинации на стекле с адсорбированными сыворотками (иммуногло­бу­линами), входящими в поливалентную. ОК-иммуноглобулины к серогруппам эшерихий используют в реакции агглютинации на стекле с живой культурой, адсорбированные сыворотки к О-антигенам эшерихий с гретой культурой (при 100 ^ОС в течение 30 минут). По результатам этих реакций проводится окончательная серологическая идентификация эшерихий (в практических лабораториях до серогруппы). Полная антигенная характеристика серовара эшерихий по О-, К-, Н-антигенам и выявление токсина SLT энтерогеморрагических кишечных палочек и энтеротоксинов ЭТКП проводится только в специализированных центрах Минздрава РФ (культуры высылать в ЦСЭН МО РФ).

Выделение из испражнений патогенных энтеробактерий - шигелл, сальмонелл, энтеропатогенных эшерихий, иерсиний псевдотуберкулеза при соответствующих клинических проявлениях заболевания достаточно для признания их этиологической роли. Этиологическое значение выделенных культур иерсиний энтероколитика следует подтверждать серологическими исследованиями (РНГА или реакцией агглютинации). Определение этиологической значимости выделенных условно-патогенных энтеробактерий проводятся по следующим критериям:

- отрицательные результаты микробиологических исследований на патогенные микроорганизмы;

- выделение культур бактерий одного рода (вида, варианта) у большинства заболевших при групповых заболеваниях;

- высеваемость бактерий вероятного возбудителя на плотных питательных средах первичного посева в необычных высоких концентрациях (чистая культура или большинство колоний) в период заболевания (в том числе при повторных исследованиях) и снижение высеваемости (вплоть до исчезновения бактерий) в период выздоровления; выделение бактерий вероятного возбудителя в период заболевания в концентрации 10⁵ и более на 1 г испражнений (при проведении количественных посевов);

- выявление нарастания титров антител в парных сыворотках (в 2 - 4 раза и более) к аутоштамму или диагностического титра в одиночных сыворотках (однако, отсутствие антител в необходимом титре не исключает этиологической значимости исследуемых бактерий);

При выдаче ответа о выделении условно-патогенных бактерий указывают данные об их росте на среде первичного посева (обильный рост, чистая культура) или концентрацию в 1 г испражнений.

Таким образом, при использовании ускоренной микрообъемной биохимической идентификации окончательная идентификация энтеробактерий с выдачей ответа завершается через 48 часов от начала исследования (при изучении посевов со сред обогащения - на сутки позже).

При необходимости (по требованию лечащего врача или эпидемиолога) определяют в тоже день исследования чувствительность бактерий к антибиотикам диско-диффузионным методом и внутривидовые ферментативные варианты шигелл Зонне, Флекснер-6, сальмонелл, используя методики, изложенные в пособии «Лабораторная диагностика в войсковом звене медицинской службы. Часть 2. Микробиологические и паразитологические исследования» (Воениздат, 1985). В случаях затруднений в идентификации атипичных штаммов проверяют их принадлежность к семейству энтеробактерий постановкой тестов на нитратредуктазу, хромогенную реакцию с 5-нитро-8-оксихинолином (на гафнии), хромогенную реакцию с 5-аминосалициловой кислотой (на клебсиеллы). Атипичные штаммы патогенных бактерий, выделенные в лабораториях санитарно-эпидемиологических и лечебных учреждений, должны контролироваться в лабораториях СЭО округа (Флота).

Колонии бактерий, выросшие на питательных средах после высева со сред обогащения, изучают по такой же схеме. При исследовании посевов крови в случае наличия роста колоний пересевают не менее трех колоний на среду Олькеницкого (без сахарозы) и желчный агар. При отсутствии колоний на среде высева делают повторный высев на среду Эндо со среды Раппопорт.

Продолжают исследование на кампилобактеры, подвергая идентификации чистые культуры, выросшие из изолированных колоний. Идентификацию проводят по следующим тестам:

- морфология клеток при окраске по Граму (кампило­бак­теры грамотрицательные спиралевидные клетки, кокковидные и гиперспиралевидные формы);

- подвижность в препарате "раздавленная капля" при микроскопии (кампилобактеры обладают стремительной подвижностью)

- наличие цитохромоксидазы тестом с 1 % водным раствором диметилпарафенилендиамина;

- наличие каталазы тестом с 3 % раствором перекиси водорода;

- температурный тест (рост на мясо-пептонно-печеночном полужидком агарепри 37^ОС в аэробных условиях при экспозиции 48 часов и отсутствие роста при 25 ^ОС);

- тест на способность к росту на среде Ресселя при 37 ^ОС в аэробных условиях (через 24 часа рост отсутствует);

- гидролиз гиппурата натрия (тест положительный только у вида С. jejuni, методика в Приложении №5);

- чувствительность к налидиксовой кислоте на эритрит-агаровой среде АГВ без крови с 50 мкг/мл налидиксовой кислоты при экспозиции 72 часа при 37 ^ОС в микроаэрофильных условиях (чувствительны С. jejuni, С. соli, устойчивы C. laridis).;

- наличие нитрат редуктазы тестом с риванолом в кислой среде (методика в Приложении №5);

По требованию лечащего врача или эпидемиолога определяется чувствительность культур кампилобактеров к антибиотикам диско-диффузионным методом.

Ч е т в е р т ы й э т а п: завершение биохимической идентификации бактерий пробирочным методом, серологическая идентификация патогенных энтеробактерий, завершение исследования со сред обогащения; проведение при необходимости дополнительных исследований; завершение исследований на возбудителей кампилобактериоза; выдача ответа о результатах исследования.

Учитывая результаты тестов пробирочного метода проводят биохимическую идентификацию бактерий по таблице №2 Приложения №4. Бактерии родов шигелла, сальмонелла, эшерихия дополнительно подвергают серологической идентификации (определение вида, серовара) по методике, изложенной на третьем этапе. Ответ о результатах исследования выдают через 72 часа от его начала (при изучении посевов со сред обогащения - на сутки позже). В ответе о выделении патогенных бактерий следует указывать род, вид и серовар микроорганизма в латинской транскрипции. При необходимости проводят дополнительные исследования: определение чувствительности бактерий к антибиотикам, выявление эпидемиологических маркеров, изучение атипичных штаммов по методикам, указанным выше. Культуры бактерий, выделенные со сред обогащения, изучают по такой же методике.

Культуры бактерий, выделенные из посевов крови, подвергают биохимической идентификации, серологической идентификации в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными О-, Н-сальмонеллезными сыворотками. При наличии типичных свойств бактерий выдают положительный ответ. Если первые два высева из среды Рапопорта (желчного бульона) были отрицательными, на 6-е сутки делают третий высев. Отрицательный ответ при посеве крови дается только после четвертого высева на 10-й день.

Отрицательный ответ может быть выдан: при исследовании желчи на 8-й день исследования после четырех отрицательных высевов на пластинчатые среды; при исследовании испражнений, секционного материала без использования сред обогащения - на 2-й день исследования (при отсутствии подозрительных колоний на пластинчатых средах первичного посева) или на 3-й день при использовании сред обогащения (при отсутствии подозрительных колоний на пластинчатых средах, засеянных со сред обогащения).

При исследовании на возбудителей кампилобактериоза завершают учет тестов идентификации, поставленных на предыдущем этапе. В соответствии с их результатами проводят идентификацию выделенных культур кампилобактеров до вида и подвида, руководствуясь таблицей №10. Выдают ответ о результатах исследования. Выделенные культуры кампилобак­теров быстро отмирают. Для их кратковременного хранения используют посевы на среду МПППА (выращивая при 42 ⁰С в аэробных условиях 48 часов), которая обеспечивает жизнеспо­собность бактерий при 4 ⁰С в течении 10 - 14 суток. Для длительного хранения следует использовать замораживание культур в присутствии криопротектора (при - 20 ⁰С), что обеспечивает выживание бактерий в течение 1 - 2 лет.

Характеристики энтеробактерий и кампилобактеров пред­ставлены в таблицах №1 – 10 Приложения №4.

Дата добавления: 2015-08-26 | Просмотры: 976 | Нарушение авторских прав