АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И РЕАКТИВОВ

Среды первичного посева

Глицериновая смесь. Транспортная среда для шигелл, сальмонелл, эшерихий. К 1 л 0,85 % раствора хлорида натрия добавляют 0,5 л химически чистого нейтрального глицерина, устанавливают рН 8,0, добавляя 20 % ра­створ двузамещенного фосфорно-кислого натрия Na₂HPO₄. Стерилизуют при температуре 112 ⁰С в течение 15 мин. После стерилизации рН должен быть равен 7,6 - 7,8.

Бактоагар Плоскирева. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке.

Агар Эндо. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке.

Агар с эозин-метиленовым синим (Левина). Сухая среда. Приготовле­ние по указанию на этикетке.

Висмут-сульфитный агар. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке.

Среды с антибиотиками. С р е д а с л е в о м и ц е т и н о м. К 1 л рас­плавленной и охлажденной до 50 - 60°С среды с эозин-метиленовым синим или бактоагара Плоскирева добавляют 2,5 мл нагретого до кипения основ­ного раствора левомицетина, т. е. концентрация препарата, в питательной среде будет равна 25 мкг/мл. Среду разливают в чашки Петри и используют для первичного посева. Приготовление основного раствора левомицетина (10000 мкг/мл): 0,1 г химически чистого порошка левомицетина помещают в пробирку с 10 мл стерильной дистиллированной воды и растворяют, на­гревая до кипения.

С р е д а с т е т р а ц и к л и н о м и а л ь б у ц и д о м н а т р и я. К 1 л расплавленной и охлажденной до 50 – 60 ⁰С среды с эозин-метиленовым си­ним или бактоагара Плоскирева добавляют 1 мл основного раствора тетра­циклина хлористоводородного и 3 мл основного раствора альбуцида нат­рия, т. е. конечная концентрация в питательной среде тетрациклина - 10 ЕД/мл, альбуцида натрия - 30 мкг/мл. Приготовление основных раство­ров:

- во флакон для инъекций, содержащий 100000 ЕД тетрациклина хлористоводородного, добавляют 10 мл стерильной дистиллированной во­ды; основной раствор тетрациклина будет содержать 10000 ЕД/мл;

- в пробирку с 0,1 г альбуцида натрия вносят 10 мл стерильной дис­тиллированной воды; основной раствор альбуцида натрия будет содержать 10000 мкг/мл.

Среда Серова. В 1 л дистиллированной воды растворяют 50 г глюкозы, 2,5 г мочевины, 1 г молибденовокислого аммония, 1 г соды безводной, 20 мл 30 % водного раствора сухой желчи, 8 мл 1,6 % водного раствора конгорот, 1 мл 1 % водного раствора генциан-фнолетового, 45 г сухого питательного агара. Компоненты смешивают, кипятят 5 мин, разливают в чашки Петри и подсушивают без крышек. Цвет среды темно-вишневый, рН 7,2 - 7,4.

Агар щелочной. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке. Предназначена для выделения вибрионов.

Щелочной мясо-пептонный агар. Состав: мясная вода - 1 л, пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, агар-агар - 20 г, рН - 7,8 - 8,2. В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20 % раствором едкого натрия до рН 8,3 - 8,4. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды в начале текучим па­ром 30 - 40 мин, затем при 120 ⁰С - 20 мин. Если среду варят на плите, то кипятят до полного растворения агар-агара. Для получения прозрачной среды ее отстаивают после варки 2 - 3 ч в автоклаве или термостате при 40 – 45 ⁰С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют рН, если требуется подкисляют (подщелачивать на данном этапе не реко­мендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации). Профильт­рованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 115 ⁰С 20 мин. Сре­да предназначена для выделения вибрионов.

Селенитовая среда. Сухая среда. Приготовление по указанию на эти­кетке.

Селенитовая среда. Состав среды: натрий кислый селенистокислый без примеси теллура (NaHSeO₃) - 4 г, пептон - 5 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный (Na₂HPO₄) 7 г, натрий фосфорнокислый однозамещенный безводный NaH₂P0₄ - 3 г, лактоза химически чистая - 4 г, во­да дистиллированная - до 1 л.

Среду готовят из двух компонентов. Сначала экспериментально опре­деляют точную пропорцию Na₂HPO₄ и NaH₂P0₄, которая с использован­ными навесками пептона и кислого селенистокислого натрия давала бы рН не выше 7,0. Такую подтитровку необходимо делать всякий раз, когда ме­няется серия любого из входящих в среду ингредиентов (пептон, фосфаты, кислый селенистокислый натрий).

Когда такое соотношение установлено, готовят раствор фосфатов, до­бавляют пептон и лактозу. Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром в течение 2 дней по 30 мин или при температуре 112 ⁰С в течение 30 мин. Отдельно на стерильной дистиллированной воде готовят 10 % раствор кислого селенистокислого натрия. Перед началом работы в каждый флакон с 50 мл основного раствора добавляют 2 мл раствора кис­лого селенистокислого натрия. Приготовленную среду разливают в сте­рильные пробирки по 5 - 7 мл и закрывают пробками. Стерилизация в ав­токлаве готовой среды не допускается, так как при этом происходит ре­дукция селенита натрия, выпадает красный осадок, и среда становится непригодной. Основной раствор среды можно хранить в холодильнике при температуре от 4 до 10 ⁰С 1 - 2 мес. Раствор кислого селенита натрия го­товят ex tempore.

Для приготовления среды большое значение имеет качество пептона. Предпочтительны пептоны производства ЧССР (фирма “Спофа”), ВНР (фирма “Г. Рихтер”), пептон из бычьего сердца ЦНИИВС им. Мечникова.

Испражнения вносят в селенитовую среду в соотношении 1: 5. Для посевов мочи, рвотных масс или промывных вод желудка следует готовить селенитовую среду удвоенной концентрации и исследуемый материал за­севать в соотношении 1:1.

Магниевая среда (среда М). Предназначена для выделения сальмонелл из испражнений и объектов внешней среды. Среда может быть при­готовлена в обычной концентрации (для исследования материала малых объемов - испражнений, пищевых продуктов, сточных жидкостей), в двой­ной концентрации (для исследования больших объемов - воды открытых водоемов, сточных жидкостей), а также в виде навесок солей и концентри­рованных растворов (“экспедиционная” модификация).

Дли приготовления 100 мл среды обычной концентрации составляют раздельно растворы А, Б, В по следующей прописи:

- р а с т в о р А: пептон Семипалатинский - 0,42 г, хлорид натрия - 0,7 г, КН₂Р0₄ - 0,15 г, дрожжевой экстракт - 2 мл, вода дистиллирован­ная - 89 мл;

- р а с т в о р Б: хлорид магния кристаллический - 3,6 г, вода дис­тиллированная - 9 мл;

- р а с т в о р В: 0,1 % водный раствор бриллиантового зеленого - 0,5 мл.

Ингредиенты растворяют, кипятят в течение 10 мин, затем растворы А, Б, В сливают в одну колбу и при необходимости разливают в стериль­ные пробирки.

Для приготовления дрожжевого экстракта 1000 г прессованных (пе­карских) дрожжей распределяют равномерно в 2000 мл дистиллированной воды, прогревают в автоклаве при 100 ⁰С 30 мин и оставляют отстаиваться в холодильнике при температуре от 4 до 5 ⁰С в течение 4 - 5 суток. Надосадочную жидкость декантируют, распределяют во флаконы по 50 - 100 мл, прибавляют по 1,25 мл 0,01 % водного раствора кристаллического фиоле­тового на каждые 100 мл экстракта, вновь прогревают при 100 ⁰С 30 мин и хранят в холодильнике.

Для выделения сальмонелл из испражнения последние в количестве 0,5 - 1 г вносят в пробирку с 5 мл магниевой среды обычной концентрации, инкубируют при 37 ⁰С 18 - 24 ч, после чего делают высев на висмут-суль­фит агар.

Среда Мюллера. В стерильные флаконы отвешивают по 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром. Наливают в каждый флакон по 90 мл бульона и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. В асептических условиях ех tempore добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора серноватисто-кислого натрия (Na₂S₂O₃) и разливают в стерильные пробирки.

Для приготовления среды используют бульон Хоттингера, содержащий 0,13 - 0,15 % аминного азота. Важное значение имеет рН среды. В связи с тем что некоторые сорта мела вызывают значительные изменения рН буль­она после автоклавирования, следует обязательно проверять реакцию каж­дой новой среды после стерилизации для установления рН 7,2 - 7,4. Для этого достаточно произвести проверку в одном из флаконов и определит необходимый для подтитровки данного количества среды объем кислоты (щелочи). Состав раствора Люголя: 20 г йодистого калия, 25 г йода, до 100 мл дистиллированной воды.

Для приготовления раствора серноватистокислого натрия в измери­тельный цилиндр насыпают 50 г серноватистокислого натрия, добавляют до 100 мл дистиллированной воды, переливают во флакон и стерилизуют текучим паром.

Среда Кауфмана. К 500 ил стерильной среды Мюллера добавляют 25 мл стерильной желчи и 5 мл 0,1 % водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам с соблюдением правил асептики. Сте­рилизовать не нужно.

Желчный бульон. Свежую желчь крупного рогатого скота фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Рекомендуется предварительно нагреть ее текучим паром при 100 ^OС в течение 1 ч, затем до фильтрования дать от­стояться. Фильтрованную горячую желчь разливают по бутылям, стерили­зуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Перед приготовлением желч­ного бульона желчь декантируют с осадка, фильтруют через ватную проб­ку (не очень плотную), вставленную в воронку, или через фильтровальную бумагу и соединяют с бульоном рН 7.2 (можно фильтровать смесь), раз­ливают по флаконам и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. При­меняют 10 - 20 % желчный бульон рН 7,5.

Среда Рапопорт. К 10 % желчному бульону добавляют 2 % глюкозы и 1 % индикатора Андреде или 0,1 % спиртового раствора (1,6 %) бромкрезолового пурпурного. Разливают по 50 мл во флаконы, куда вставляют по­плавки для обнаружения газообразования. Поплавками служат стеклян­ные трубочки длиной 60 - 70 мм и диаметром 8 мм, которые помещают во флаконы открытым концом вниз. Стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. При росте тифозных и паратифозных бактерий среда с индикатором Андреде краснеет, с индикатором бромкрезоловым пурпурным жел­теет. При росте газообразующих бактерий в верхнем конце трубочки со­бирается газ.

Фосфатно-буферный раствор. Предназначен для холодового накопле­ния иерсиний. Для получения рН 7,4 - 7,6 готовят два раствора (А и Б), которые затем соединяют в нужной пропорции.

Р а с т в о р А: готовят 1/15-молярный раствор КН₂РО₄, для чего 9,08 г препарата растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Р а с т в о р Б: готовят 1/15-молярный раствор Nа₂НР0₄-2Н₂О, для чего 11,88 г препарата растворяют в 1 л дистиллированной воды. Для по­лучения буферного раствора с рН 7,4 - 7,6 соединяют 150 мл раствора А и 850 мл раствора Б, разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 120°С 30 - 60 мин.

1 % щелочная пептонная вода. Вначале готовят основной раствор пеп­тона (10 % пептонную воду) по прописи: пептон - 100 г, хлорид натрия - 50 г, нитрат калия - 1 г, карбонат натрия - 25 г, вода дистиллирован­ная - 1 л, рН - 8,0 - 8,2. В холодную дистиллированную воду вносят пеп­тон, хлорид натрия, карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, затем добавляют нитрат ка­лия. Корригируют рН среды до 8,0 - 8,2. Фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве при 120 ⁰С 20 мин. Основной раствор пептона сохраняется до двух лет.

Для получения 1% щелочной пептонной воды основной раствор пеп­тона разводят в 10 раз дистиллированной водой. Устанавливают рН 8,2 - 8,4, разливают в пробирки (флаконы), стерилизуют при 115 ⁰С в течение 20 мин. Среда предназначена для выделения вибрионов.

Пептон основной. Сухая среда. Приготовление по указанию на эти­кетке.

Среда КОДА. Сухая среда. Предназначена для исследования смывов на бактерии группы кишечных палочек. Приготовление в соответствии с указанием на этикетке. Готовую среду разливают по 5 и 10 мл в пробирки без поплавков.

Среда Кесслер с лактозой. Предназначена для исследования смывов на бактерии группы кишечных палочек. К 1 л водопроводной воды прибав­ляют 10 г пептона и 50 мл желчи крупного рогатого скота, кипятят смесь 20 - 30 мин в водяной бане, фильтруют через вату. В полученном фильтра­те растворяют 1,5 г лактозы и доводят объем до 1 л, устанавливают рН 7,4 - 7,6, после чего добавляют 2 мл 1 % водного раствора кристалличе­ского фиолетового, разливают в пробирки по 5 и 10 мл, во флаконы по 50 мл. Стерилизуют при 121 ⁰С 10 мин, предварительно опустив в пробирки поплавки. Готовая среда имеет темно-фиолетовый цвет.

Среды и реактивы для ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий методом микрокультур в планшетах

(по Е. П. Сиволодскому, Н. А. Луканову, 1984)

Желчный агар. К 900 мл расплавленного стерильного питательного агара добавляют 100 мл стерильной желчи крупного рогатого скота, пере­мешивают, разливают в стерильные чашки Петри. Вместо нативной желчи можно добавлять сухую желчь в количестве 1 % с последующей стерили­зацией среды при 112 ⁰С в течение 20 мин. Среда предназначена для подращивания чистой культуры бактерий с торможением роста протея.

Фосфатные буферные смеси. В отдельных колбах готовят 1/15-молярные растворы фосфата калия однозамещенного и фосфата натрия двузамещенного (выветренного) по следующей прописи: KH₂P0₄ - 9,078 г на 1 л дистиллированной воды и Na₂HP0₄-2H₂O - 11,876 на 1 л дистиллиро­ванной воды. Для получения фосфатного буфера с определенным рН сме­шивают указанные растворы в отдельной колбе в необходимой пропорции. Фосфатный буфер рН 7,0: Nа₂НРО₄ - 6 частей, КН₂Р0₄ - 4 части. Фос­фатный буфер рН 7,6: Na₂HPO₄ - 8,5 части, КН₂Р0₄ - 1,5 части. Строго контролируют рН с помощью рН-метра. При необходимости корригируют рН изменением соотношения фосфатов (не допускается коррекция кисло­той или щелочью).

0,4 % водно-щелочной раствор фенолового красного. В агатовой ступ­ке перетирают 0,1 г порошка фенолового красного в 5,7 мл 0,2 % раствора едкого натра. После растворения добавляют дистиллированную воду до 25 мл. Переливают раствор индикатора во флакон с притертой пробкой.

Среда для определения уреазы. Смешивают: фосфатный буфер (рН 7,0) - 100 мл, хлорид натрия - 2,5 г, воду дистиллированную - до 500 мл. Проверяют и устанавливают рН 7,0. Добавляют 2,5 мл 0,4 % водно-щелочного раствора фенолового красного. Разливают основу среды во фла­коны по 100 мл. Стерилизуют при 120 ⁰С 30 мин. К 100 мл стерильной осно­вы среды добавляют 2 мл 50 % водного раствора мочевины (50 % раствор мочевины самостерилизуется). Использовать среду с мочевиной без повторной стерилизации, сохраняя при 4 ⁰С.

Среда для определения ферментации углеводов и спиртов (лактозы, адонита, сахарозы, сорбита, маниита, арабинозы). Смешивают: фосфатный буфер (рН 7,6) - 100 мл, хлорид натрия - 2,5, воду дистиллированную - до 500 мл. Проверяют и устанавливают рН 7,6. Добавляют 2,5 мл 0,4 % вод­но-щелочного раствора фенолового красного. Разливают основу среды во флаконы по 100 мл. Стерилизуют при 120 ⁰С 30 мин. Добавляют во флако­ны с 100 мл стерильной основы среды по одному виду углеводов (спиртов) в следующем количестве: лактоза, сахароза - 4 г, сорбит, маннит, арабиноза - З г, адонит - 1 г. Среды с углеводами и спиртами используют без повторной сте­рилизации, сохраняя при 4 ⁰С.

Среда для определения триптофаидезаминазы и индола. Состав: пеп­тон сухой ферментативный (Семипалатинский) - 1 г, натрия хлорид - 0,5 г, L-триптофан - 0,5 г, вода дистиллированная - до 100 мл. Стери­лизовать при 120 ⁰С 30 мин.

Среда для выявления сероводорода. Состав: соль Мора - 0,04 г, гипо­сульфит - 0,06 г, бульон из рыбного гидролизата (рН 7,5) - 100 мл. Стерилизовать при 120 ⁰С 30 мин.

Среда для выявления ацетоина реакцией Фогеса-Проскауэра. Состав: пептон сухой ферментативный (Семипалатинский) - 1,5 г, глюкоза - 1 г, калий фосфорнокислый двузамещенный (К₂HP0₄) - 1 г, вода дистиллиро­ванная - до 100 мл. Стерилизовать при 112 ⁰С 20 мин.

Среда для определения лизиндекарбоксилазы. Основа среды: пептон сухой ферментативный (Семипалатинский) - 0,5 г; мясная вода - 25 мл; натрия хлорид - 1,5 г; магний сернокислый - 0,05 г; калий фосфорнокис­лый однозамещенный - 0,75 г; никотиновая кислота - 0,1 г; витамин B₆ - 0,05 г; 1,6 % спиртовой раствор бромтимолового синего - 2,5 мл: вода дис­тиллированная - до 500 мл; рН - 5,6. Стерилизовать при 120 ⁰С 30 мин. Добавить к 100 мл стерильной основы среды 1 г L-лизина. Использовать среду с лизином без повторной стерилизации, сохраняя при 4 ⁰С.

Реактив на индол (реактив Ковача). Состав: парадиметиламинобензальдегид - 5 г, амиловый спирт - 75 мл, кислота соляная концентриро­ванная - 25 мл. Растворить альдегид в спирте, затем медленно добавить кислоту. Хранить и темном флаконе с притертой пробкой,

Реактив на триптофандезаминазу. Состав: 50 мл 10 % водного раство­ра хлорного железа (FeCI₃) и 50 мл 10 % раствора соляной кислоты, со­вмещенные в одном флаконе.

Дата добавления: 2015-08-26 | Просмотры: 2669 | Нарушение авторских прав