АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И РЕАКТИВОВ
Среды первичного посева
Глицериновая смесь. Транспортная среда для шигелл, сальмонелл, эшерихий. К 1 л 0,85 % раствора хлорида натрия добавляют 0,5 л химически чистого нейтрального глицерина, устанавливают рН 8,0, добавляя 20 % раствор двузамещенного фосфорно-кислого натрия Na2HPO4. Стерилизуют при температуре 112 0С в течение 15 мин. После стерилизации рН должен быть равен 7,6 - 7,8.
Бактоагар Плоскирева. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке.
Агар Эндо. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке.
Агар с эозин-метиленовым синим (Левина). Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке.
Висмут-сульфитный агар. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке.
Среды с антибиотиками. С р е д а с л е в о м и ц е т и н о м. К 1 л расплавленной и охлажденной до 50 - 60°С среды с эозин-метиленовым синим или бактоагара Плоскирева добавляют 2,5 мл нагретого до кипения основного раствора левомицетина, т. е. концентрация препарата, в питательной среде будет равна 25 мкг/мл. Среду разливают в чашки Петри и используют для первичного посева. Приготовление основного раствора левомицетина (10000 мкг/мл): 0,1 г химически чистого порошка левомицетина помещают в пробирку с 10 мл стерильной дистиллированной воды и растворяют, нагревая до кипения.
С р е д а с т е т р а ц и к л и н о м и а л ь б у ц и д о м н а т р и я. К 1 л расплавленной и охлажденной до 50 – 60 0С среды с эозин-метиленовым синим или бактоагара Плоскирева добавляют 1 мл основного раствора тетрациклина хлористоводородного и 3 мл основного раствора альбуцида натрия, т. е. конечная концентрация в питательной среде тетрациклина - 10 ЕД/мл, альбуцида натрия - 30 мкг/мл. Приготовление основных растворов:
- во флакон для инъекций, содержащий 100000 ЕД тетрациклина хлористоводородного, добавляют 10 мл стерильной дистиллированной воды; основной раствор тетрациклина будет содержать 10000 ЕД/мл;
- в пробирку с 0,1 г альбуцида натрия вносят 10 мл стерильной дистиллированной воды; основной раствор альбуцида натрия будет содержать 10000 мкг/мл.
Среда Серова. В 1 л дистиллированной воды растворяют 50 г глюкозы, 2,5 г мочевины, 1 г молибденовокислого аммония, 1 г соды безводной, 20 мл 30 % водного раствора сухой желчи, 8 мл 1,6 % водного раствора конгорот, 1 мл 1 % водного раствора генциан-фнолетового, 45 г сухого питательного агара. Компоненты смешивают, кипятят 5 мин, разливают в чашки Петри и подсушивают без крышек. Цвет среды темно-вишневый, рН 7,2 - 7,4.
Агар щелочной. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке. Предназначена для выделения вибрионов.
Щелочной мясо-пептонный агар. Состав: мясная вода - 1 л, пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, агар-агар - 20 г, рН - 7,8 - 8,2. В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20 % раствором едкого натрия до рН 8,3 - 8,4. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды в начале текучим паром 30 - 40 мин, затем при 120 0С - 20 мин. Если среду варят на плите, то кипятят до полного растворения агар-агара. Для получения прозрачной среды ее отстаивают после варки 2 - 3 ч в автоклаве или термостате при 40 – 45 0С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют рН, если требуется подкисляют (подщелачивать на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации). Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 115 0С 20 мин. Среда предназначена для выделения вибрионов.
Селенитовая среда. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке.
Селенитовая среда. Состав среды: натрий кислый селенистокислый без примеси теллура (NaHSeO3) - 4 г, пептон - 5 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный (Na2HPO4) 7 г, натрий фосфорнокислый однозамещенный безводный NaH2P04 - 3 г, лактоза химически чистая - 4 г, вода дистиллированная - до 1 л.
Среду готовят из двух компонентов. Сначала экспериментально определяют точную пропорцию Na2HPO4 и NaH2P04, которая с использованными навесками пептона и кислого селенистокислого натрия давала бы рН не выше 7,0. Такую подтитровку необходимо делать всякий раз, когда меняется серия любого из входящих в среду ингредиентов (пептон, фосфаты, кислый селенистокислый натрий).
Когда такое соотношение установлено, готовят раствор фосфатов, добавляют пептон и лактозу. Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром в течение 2 дней по 30 мин или при температуре 112 0С в течение 30 мин. Отдельно на стерильной дистиллированной воде готовят 10 % раствор кислого селенистокислого натрия. Перед началом работы в каждый флакон с 50 мл основного раствора добавляют 2 мл раствора кислого селенистокислого натрия. Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5 - 7 мл и закрывают пробками. Стерилизация в автоклаве готовой среды не допускается, так как при этом происходит редукция селенита натрия, выпадает красный осадок, и среда становится непригодной. Основной раствор среды можно хранить в холодильнике при температуре от 4 до 10 0С 1 - 2 мес. Раствор кислого селенита натрия готовят ex tempore.
Для приготовления среды большое значение имеет качество пептона. Предпочтительны пептоны производства ЧССР (фирма “Спофа”), ВНР (фирма “Г. Рихтер”), пептон из бычьего сердца ЦНИИВС им. Мечникова.
Испражнения вносят в селенитовую среду в соотношении 1: 5. Для посевов мочи, рвотных масс или промывных вод желудка следует готовить селенитовую среду удвоенной концентрации и исследуемый материал засевать в соотношении 1:1.
Магниевая среда (среда М). Предназначена для выделения сальмонелл из испражнений и объектов внешней среды. Среда может быть приготовлена в обычной концентрации (для исследования материала малых объемов - испражнений, пищевых продуктов, сточных жидкостей), в двойной концентрации (для исследования больших объемов - воды открытых водоемов, сточных жидкостей), а также в виде навесок солей и концентрированных растворов (“экспедиционная” модификация).
Дли приготовления 100 мл среды обычной концентрации составляют раздельно растворы А, Б, В по следующей прописи:
- р а с т в о р А: пептон Семипалатинский - 0,42 г, хлорид натрия - 0,7 г, КН2Р04 - 0,15 г, дрожжевой экстракт - 2 мл, вода дистиллированная - 89 мл;
- р а с т в о р Б: хлорид магния кристаллический - 3,6 г, вода дистиллированная - 9 мл;
- р а с т в о р В: 0,1 % водный раствор бриллиантового зеленого - 0,5 мл.
Ингредиенты растворяют, кипятят в течение 10 мин, затем растворы А, Б, В сливают в одну колбу и при необходимости разливают в стерильные пробирки.
Для приготовления дрожжевого экстракта 1000 г прессованных (пекарских) дрожжей распределяют равномерно в 2000 мл дистиллированной воды, прогревают в автоклаве при 100 0С 30 мин и оставляют отстаиваться в холодильнике при температуре от 4 до 5 0С в течение 4 - 5 суток. Надосадочную жидкость декантируют, распределяют во флаконы по 50 - 100 мл, прибавляют по 1,25 мл 0,01 % водного раствора кристаллического фиолетового на каждые 100 мл экстракта, вновь прогревают при 100 0С 30 мин и хранят в холодильнике.
Для выделения сальмонелл из испражнения последние в количестве 0,5 - 1 г вносят в пробирку с 5 мл магниевой среды обычной концентрации, инкубируют при 37 0С 18 - 24 ч, после чего делают высев на висмут-сульфит агар.
Среда Мюллера. В стерильные флаконы отвешивают по 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром. Наливают в каждый флакон по 90 мл бульона и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. В асептических условиях ех tempore добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора серноватисто-кислого натрия (Na2S2O3) и разливают в стерильные пробирки.
Для приготовления среды используют бульон Хоттингера, содержащий 0,13 - 0,15 % аминного азота. Важное значение имеет рН среды. В связи с тем что некоторые сорта мела вызывают значительные изменения рН бульона после автоклавирования, следует обязательно проверять реакцию каждой новой среды после стерилизации для установления рН 7,2 - 7,4. Для этого достаточно произвести проверку в одном из флаконов и определит необходимый для подтитровки данного количества среды объем кислоты (щелочи). Состав раствора Люголя: 20 г йодистого калия, 25 г йода, до 100 мл дистиллированной воды.
Для приготовления раствора серноватистокислого натрия в измерительный цилиндр насыпают 50 г серноватистокислого натрия, добавляют до 100 мл дистиллированной воды, переливают во флакон и стерилизуют текучим паром.
Среда Кауфмана. К 500 ил стерильной среды Мюллера добавляют 25 мл стерильной желчи и 5 мл 0,1 % водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам с соблюдением правил асептики. Стерилизовать не нужно.
Желчный бульон. Свежую желчь крупного рогатого скота фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Рекомендуется предварительно нагреть ее текучим паром при 100 OС в течение 1 ч, затем до фильтрования дать отстояться. Фильтрованную горячую желчь разливают по бутылям, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Перед приготовлением желчного бульона желчь декантируют с осадка, фильтруют через ватную пробку (не очень плотную), вставленную в воронку, или через фильтровальную бумагу и соединяют с бульоном рН 7.2 (можно фильтровать смесь), разливают по флаконам и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. Применяют 10 - 20 % желчный бульон рН 7,5.
Среда Рапопорт. К 10 % желчному бульону добавляют 2 % глюкозы и 1 % индикатора Андреде или 0,1 % спиртового раствора (1,6 %) бромкрезолового пурпурного. Разливают по 50 мл во флаконы, куда вставляют поплавки для обнаружения газообразования. Поплавками служат стеклянные трубочки длиной 60 - 70 мм и диаметром 8 мм, которые помещают во флаконы открытым концом вниз. Стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. При росте тифозных и паратифозных бактерий среда с индикатором Андреде краснеет, с индикатором бромкрезоловым пурпурным желтеет. При росте газообразующих бактерий в верхнем конце трубочки собирается газ.
Фосфатно-буферный раствор. Предназначен для холодового накопления иерсиний. Для получения рН 7,4 - 7,6 готовят два раствора (А и Б), которые затем соединяют в нужной пропорции.
Р а с т в о р А: готовят 1/15-молярный раствор КН2РО4, для чего 9,08 г препарата растворяют в 1 л дистиллированной воды.
Р а с т в о р Б: готовят 1/15-молярный раствор Nа2НР04-2Н2О, для чего 11,88 г препарата растворяют в 1 л дистиллированной воды. Для получения буферного раствора с рН 7,4 - 7,6 соединяют 150 мл раствора А и 850 мл раствора Б, разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 120°С 30 - 60 мин.
1 % щелочная пептонная вода. Вначале готовят основной раствор пептона (10 % пептонную воду) по прописи: пептон - 100 г, хлорид натрия - 50 г, нитрат калия - 1 г, карбонат натрия - 25 г, вода дистиллированная - 1 л, рН - 8,0 - 8,2. В холодную дистиллированную воду вносят пептон, хлорид натрия, карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, затем добавляют нитрат калия. Корригируют рН среды до 8,0 - 8,2. Фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве при 120 0С 20 мин. Основной раствор пептона сохраняется до двух лет.
Для получения 1% щелочной пептонной воды основной раствор пептона разводят в 10 раз дистиллированной водой. Устанавливают рН 8,2 - 8,4, разливают в пробирки (флаконы), стерилизуют при 115 0С в течение 20 мин. Среда предназначена для выделения вибрионов.
Пептон основной. Сухая среда. Приготовление по указанию на этикетке.
Среда КОДА. Сухая среда. Предназначена для исследования смывов на бактерии группы кишечных палочек. Приготовление в соответствии с указанием на этикетке. Готовую среду разливают по 5 и 10 мл в пробирки без поплавков.
Среда Кесслер с лактозой. Предназначена для исследования смывов на бактерии группы кишечных палочек. К 1 л водопроводной воды прибавляют 10 г пептона и 50 мл желчи крупного рогатого скота, кипятят смесь 20 - 30 мин в водяной бане, фильтруют через вату. В полученном фильтрате растворяют 1,5 г лактозы и доводят объем до 1 л, устанавливают рН 7,4 - 7,6, после чего добавляют 2 мл 1 % водного раствора кристаллического фиолетового, разливают в пробирки по 5 и 10 мл, во флаконы по 50 мл. Стерилизуют при 121 0С 10 мин, предварительно опустив в пробирки поплавки. Готовая среда имеет темно-фиолетовый цвет.
Среды и реактивы для ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий методом микрокультур в планшетах
(по Е. П. Сиволодскому, Н. А. Луканову, 1984)
Желчный агар. К 900 мл расплавленного стерильного питательного агара добавляют 100 мл стерильной желчи крупного рогатого скота, перемешивают, разливают в стерильные чашки Петри. Вместо нативной желчи можно добавлять сухую желчь в количестве 1 % с последующей стерилизацией среды при 112 0С в течение 20 мин. Среда предназначена для подращивания чистой культуры бактерий с торможением роста протея.
Фосфатные буферные смеси. В отдельных колбах готовят 1/15-молярные растворы фосфата калия однозамещенного и фосфата натрия двузамещенного (выветренного) по следующей прописи: KH2P04 - 9,078 г на 1 л дистиллированной воды и Na2HP04-2H2O - 11,876 на 1 л дистиллированной воды. Для получения фосфатного буфера с определенным рН смешивают указанные растворы в отдельной колбе в необходимой пропорции. Фосфатный буфер рН 7,0: Nа2НРО4 - 6 частей, КН2Р04 - 4 части. Фосфатный буфер рН 7,6: Na2HPO4 - 8,5 части, КН2Р04 - 1,5 части. Строго контролируют рН с помощью рН-метра. При необходимости корригируют рН изменением соотношения фосфатов (не допускается коррекция кислотой или щелочью).
0,4 % водно-щелочной раствор фенолового красного. В агатовой ступке перетирают 0,1 г порошка фенолового красного в 5,7 мл 0,2 % раствора едкого натра. После растворения добавляют дистиллированную воду до 25 мл. Переливают раствор индикатора во флакон с притертой пробкой.
Среда для определения уреазы. Смешивают: фосфатный буфер (рН 7,0) - 100 мл, хлорид натрия - 2,5 г, воду дистиллированную - до 500 мл. Проверяют и устанавливают рН 7,0. Добавляют 2,5 мл 0,4 % водно-щелочного раствора фенолового красного. Разливают основу среды во флаконы по 100 мл. Стерилизуют при 120 0С 30 мин. К 100 мл стерильной основы среды добавляют 2 мл 50 % водного раствора мочевины (50 % раствор мочевины самостерилизуется). Использовать среду с мочевиной без повторной стерилизации, сохраняя при 4 0С.
Среда для определения ферментации углеводов и спиртов (лактозы, адонита, сахарозы, сорбита, маниита, арабинозы). Смешивают: фосфатный буфер (рН 7,6) - 100 мл, хлорид натрия - 2,5, воду дистиллированную - до 500 мл. Проверяют и устанавливают рН 7,6. Добавляют 2,5 мл 0,4 % водно-щелочного раствора фенолового красного. Разливают основу среды во флаконы по 100 мл. Стерилизуют при 120 0С 30 мин. Добавляют во флаконы с 100 мл стерильной основы среды по одному виду углеводов (спиртов) в следующем количестве: лактоза, сахароза - 4 г, сорбит, маннит, арабиноза - З г, адонит - 1 г. Среды с углеводами и спиртами используют без повторной стерилизации, сохраняя при 4 0С.
Среда для определения триптофаидезаминазы и индола. Состав: пептон сухой ферментативный (Семипалатинский) - 1 г, натрия хлорид - 0,5 г, L-триптофан - 0,5 г, вода дистиллированная - до 100 мл. Стерилизовать при 120 0С 30 мин.
Среда для выявления сероводорода. Состав: соль Мора - 0,04 г, гипосульфит - 0,06 г, бульон из рыбного гидролизата (рН 7,5) - 100 мл. Стерилизовать при 120 0С 30 мин.
Среда для выявления ацетоина реакцией Фогеса-Проскауэра. Состав: пептон сухой ферментативный (Семипалатинский) - 1,5 г, глюкоза - 1 г, калий фосфорнокислый двузамещенный (К2HP04) - 1 г, вода дистиллированная - до 100 мл. Стерилизовать при 112 0С 20 мин.
Среда для определения лизиндекарбоксилазы. Основа среды: пептон сухой ферментативный (Семипалатинский) - 0,5 г; мясная вода - 25 мл; натрия хлорид - 1,5 г; магний сернокислый - 0,05 г; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,75 г; никотиновая кислота - 0,1 г; витамин B6 - 0,05 г; 1,6 % спиртовой раствор бромтимолового синего - 2,5 мл: вода дистиллированная - до 500 мл; рН - 5,6. Стерилизовать при 120 0С 30 мин. Добавить к 100 мл стерильной основы среды 1 г L-лизина. Использовать среду с лизином без повторной стерилизации, сохраняя при 4 0С.
Реактив на индол (реактив Ковача). Состав: парадиметиламинобензальдегид - 5 г, амиловый спирт - 75 мл, кислота соляная концентрированная - 25 мл. Растворить альдегид в спирте, затем медленно добавить кислоту. Хранить и темном флаконе с притертой пробкой,
Реактив на триптофандезаминазу. Состав: 50 мл 10 % водного раствора хлорного железа (FeCI3) и 50 мл 10 % раствора соляной кислоты, совмещенные в одном флаконе.
Дата добавления: 2015-08-26 | Просмотры: 2771 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 |
|