АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Среды для выделения термофильных кампилобактеров из биологических субстратов

1. Железо-эритрит-кровяной агар (ЖЭКА). Среда готовится из комерческого препарата “Эритрит-агар”, выпускаемого НПО “Питательные среды” г. Махачкала. Навеска сухого эритрит-агара (36 г) растворяется при нагревании в 1 л дистиллированной воды, затем добавляют экстракт кормовых дрожжей (4 г) и сернокислое закисное железо (0,04 - 0,15 г). Среда кипятится на медленном огне 3 - 5 минут, затем стерилизуется при 121 ⁰С в течение 20 минут. К остуженной после стерилизации до 40 - 50 ⁰С питательной среде добавляются 7 % лизированной бараньей крови (или 10 % цельной бараньей, или 7 % лизированной лошадиной, или 5 % лизированной человеческой донорской крови), а также раствор смеси антибиотиков (см. ниже). Среда перемешивается и разливается в стерильные чашки. Чашки со средой хранят при 4 ⁰С до 14 суток. Перед употреблением среду подсушивают в термостате при 37 ⁰С в течени 40 - 60 минут.

Примечание: каждая серия среды ЖЭКА подлежит проверке на поддержание жизнеспособности кампилобактеров путем титрованного высева штамма Campylobacter jejuni (M457Z), который может быть получен в Центарльном НИИ эпидемиологии МЗ РФ (111123, Москва, ул. Новогиреевская 3а).

2. Селективный эритрит агар. Среда готовится аналогично среде ЖЭКА, но дополнительно включает 0,05 % пирувата и 0,05 % метабисульфит натрия.

К р о в я н ы е д о б а в к и. Баранья или лошадиная кровь, асептически взятая у здоровых животных, дефибринируется с помощью стеклянных бус и хранится до использования при 4 ^ОС в течение 7 - 10 дней. Человеческая донорская кровь используется в виде прпарата ”Гемолизированная кровь для питательных сред “ Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера.

Смеси антибиотиков.

С м е с ь №1: рифампицина - 20 мг/л, фузидин - 10 мг/л, амфотерицин В - 3 мг/л, цефалотин - 15 мг/л.

С м е с ь №2: полимиксин В - 2 мг/л, рифампицин 10 мг/л, амфотерицин В 3 мг/л, ристомицин - 10 мг/л.

Необходимые количества антибиотиков взвешивают и вносят во флакон с 3 мл дистиллированной воды и 0,05 мл диметилсульфоксида (или 5 - 7 каплями этилового спирта), растворяют смесь при тщательном перемешивании.

3. Среда с активированным углем для выделения термофильных кампилобактеров с помощью фильтров. Состав среды: эритрит-агар коммерческий - 36 г; сернокислое закисное железо - 0,15 г; экстракт кормовых дрожжей - 4 г; уголь бактериологический активированный - 4 г; вода дистиллированная - 1 л; рН - 7,2 - 7,4. Среда готовится аналогично среде ЖЭКА, стерилизуется при 121 ^ОС в течение 20 минут, разливается в стерильные чашки. Чашки со средой хранят при 4 ⁰С до 14 - 20 суток, перед употреблением подсушивают в термостате при 37 ⁰С в течение 40 - 60 минут.

М е м б р а н н ы е ф и л ь т р ы.

Мембранные фильтры типа “Владипор” №5 и №6 производства Казанского ПО “Тасма” подготавливают к употреблению следующим образом. Необходимое для посева количество фильтров №6 дважды отмывают кипячением в дистиллированной воде, после чего кипятят третий раз в 0,01 % растворе Твин-20 или Твин-80, стерильным пинцетом укладывают на поверхность питательной среды, после чего чашки подсушивают в термостате при 37 ⁰С до исчезновения крупных капель воды (примерно 30 - 40 минут).

Я д е р н ые ф и л ь т р ы.

Ядерные фильтры производятся Объединным институтом ядерных исследований (141980, Московская область, г. Дубна. Отдел прикладной ядерной физики). Фильтры готовят к работе одним из следующих способов: а) полотно ядерного фильтра разрезается ножницами на квадраты 2 х 2 см, квадраты перекладываются бумагой и стерилизуются в автоклаве при 121 ⁰С в течение 20 минут или в сухожаровом шкафу при температуре 170 ⁰С в течение 60 минут; б) вырезанные из полотна кусочки ядерного фильтра размером 3 х 3 см с помощью резинового кольца закрепляются в металлическом кольце диаметром 15 - 20 мм и высотой 5 - 7 мм; полученные таким образом обоймы укладываются в футляр и стерилизуются в режиме 121 ⁰С в течение 20 минут. В отличие от мембранных, ядерные фильтры могут быть использованы неоднократно после обеззараживания кипяченим, промывания водопроводной водой и стерилизации.

Тест на способность к быстрому гидролизу гиппурата натрия. Методика теста должна строго соответствовать предложенной схеме. Материал суточной агаровой культуры испытуемого штамма суспендируют в 0,4 мл 1 % водного раствора гиппурата натрия до мутности, соответствующей 10 единицам стандарта мутности; постановка теста проводится в преципитационных пробирках. Опытный образец инкубируют при 37 ⁰С в течение 2 часов на водяной бане или в термостате, после чего к суспензии исследуемого штамма по стенке наклоненной под углом 45⁰ преципитационной пробирки остороно наслаивается 0,2 мл нингидринового реактива (3,5 % раствор нингидрина в смеси ацетона и бутанола, взятых в соотношении 1:1 по объему). Нингидриновый реактив готовится ex tempore. Пробирки, тщательно защищенные от случайного встряхивания, вновь помещают на водяную баню на 10 минут, после чего производят учет результатов: о способности культуры к быстрому гидролизу гиппурата натрия свидетельствует образование темно-фиолетового окрашивания суспензии исследуемой культуры. Появление фиолетового кольца или сиреневой окраски суспензии требует перестановки теста. Окончательный отрицательный результат может быть получен лишь спустя сутки дополнительной инкубации при 37 ⁰С в термостате: появление темно-фиолетового кольца спустя сутки расценивается как сомнительный результат, требующий уточнения с помощью повторной перестановки теста. Следует учесть, что раствор гиппурата натрия не стойкий, поэтому подлежит хранению при температуре не превышающей - 20 ⁰С.

Дата добавления: 2015-08-26 | Просмотры: 983 | Нарушение авторских прав