Пояснения по методам лабораторной диагностики вирусных инфекций
I. Экспресс-диагностика – обнаружение вируса или его антигенов в исследуемом материале:
1. Обнаружение внутриклеточных включений (бешенство, герпетическая инфекция, натуральная и ветряная оспа) и элементарных телец (натуральная оспа) с помощью специальных методов окраски и обычной световой микроскопии.
a) Элементарные тельца – это отдельные крупные вирионы, имеющие размеры до 200 нм и видимые при особых методах окраски (по Морозову, Романовскому-Гимзе) в световой микроскоп: элементарные тельца Пашена при натуральной оспе в содержимом везикул и пустул.
б) В клетках, пораженных некоторыми вирусами, можно наблюдать образование вирусных включений, локализующихся в цитоплазме (тельца Бабеша-Негри при бешенстве, тельца Гварниери при натуральной оспе), или в ядре (при инфекции, вызванной аденовирусами, герпесвирусами). Природа не всех вирусных внутриклеточных включений ясна. Тельца Бабеша-Негри при бешенстве, по данным японских ученых, являются местом продукции вирионов, т.е. колониями элементарных частиц. При герпесе включения на ранней стадии формирования представляют собой скопления вирионов. Включения окрашиваются по Романовскому-Гимзе, Туревичу, Муромцеву (при бешенстве).
2. РИФ, ИФА, РИА, ЭМ, ИЭМ.
а) ЭМ (электронная микроскопия) – позволяет обнаружить возбудителя в клиническом материале при негативном контрастировании. Этот метод требует достаточно высокой концентрации возбудителя в материале (104-105 частиц/мл).
б) Обнаружение антигенов вирусов:
- РИФ (с использованием диагностических люминесцирующих сывороток)
- ИФА (иммуноферментный анализ) – это высокочувствительный, быстрый метод, технически простой и доступный. Применяется для быстрой диагностики гепатитов, респираторных инфекций, гастроэнтеритов (ротавирусных инфекций). Чаще всего для обнаружения антигенов вирусов используется сэндвич-вариант постановки ИФА. Для его постановки используют плоскодонный полистирольный иммунологический планшет, на дне лунок которого фиксированны антитела к антигенам вируса (первые антитела). В лунки вносят образец исследуемого материала, инкубируют при определенной температуре, затем промывают лунки специальными буферными растворами. После отмывки вносят вторые антитела, конъюгированные с ферментом (чаще всего – пероксидаза хрена), инкубируют. По окончании инкубации лунки снова тщательно промывают и заполняют субстрат-индикаторной смесью – перекись водорода и тетраметилбензидин (ТМБ) или ортофенилендиамин (ОФД) – и инкубируют при комнатной температуре в темном месте, после чего реакцию необходимо остановить добавлением стоп-реагента (раствор серной или соляной кислоты). Индикатор (хромоген) в присутствии активных радикалов кислорода, образующихся в процессе ферментации перекиси водорода пероксидазой, изменяет свой цвет с бесцветного на синий (ТМБ) или желто-коричневый (ОФД). После остановки реакции при использовании ТМБ цвет раствора изменяется на желтый, а при использовании ОФД становится темнее. Учет реакции ведется в фотоколориметре с вертикальным направлением освещения при длине волны 450 нм для ТМБ и 492 нм для ОФД против контрольных положительной и отрицательной проб.
- РИА (радиоиммунный анализ), разновидность твердофазного иммунологического анализа, когда один из известных компонентов имеет радиоактивную метку. Результаты учитываются с помощью счетчика или авторадиографии, используя рентгеновскую пленку. Для выявления АГ исследуемый материал смешивают со специфической сывороткой, а затем через определенное время вносят гомологичный АГ, меченый радиоактивным изотопом. При этом между анигеном исследуемого материала и меченным антигеном возникает конкуренция за связывание со специфической сывороткой. Если меченый АГ остается свободным, реакция считается положительной, поскольку исследуемый АГ связался с диагностической сывороткой. Такой вариант иммуноанализа называется конкурентным.
- ИЭМ (иммунная электронная микроскопия) – отличается от обычной ЭМ предварительной обработкой исследуемого материала специфическими антителами, мечеными атомом металла. Подобная обработка приводит к тому, что при просмотре электронограммы интересуемые объекты (вирусные частицы) проявляются более четко благодаря большей электронопоглощающей способности металла. Это позволяет выявить возбудителя и одновременно его идентифицировать.
3. Обнаружение нуклеиновой кислоты вируса метод ПЦР.
II. Вирусологический метод – выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация:
1-ый этап – накопление вирусов:
- накопление в культуре клеток и тканей
Культуры тканей стали активно использоваться с 50-х годов, когда в практику вошли антибиотики (прекратились бактериальные проросты ткани), были разработаны синтетические питательные среды, а главным стимулом послужило выявление ЦПД у вирусов. С 1954 года стали использовать метод однослойных культур тканей. Существует 3 типа тканевых культур:
· первично-трипсинизированные (неперевиваемые)
· полуперевиваемые
· перевиваемые
Первично-трипсинизированные культуры получают из различных тканей: кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, куриных, мышиных, из почек различных эмбрионов, из легких, из роговицы глаза кролика и т. д. Ткань измельчают, обрабатывают трипсином, освобождают от детрита, стандартизуют число клеток, взвешенных в питательной среде с антибиотиками, разливают в пробирки или флаконы. Полуперевиваемые культуры – это культуры из диплоидных клеток, способные вне организма выдерживать 40-50 пассажей благодаря двойному набору хромосом, после чего отмирают. Перевиваемые культуры существуют вне организма очень долго. Они получены из нормальных тканей, из злокачественных, эмбриональных. Перевиваемые линии культур тканей: Нер-2 (злокачественные клетки из опухоли гортани человека), НеLа (злокачественные клетки из раковой опухоли шейки матки), Детройт-6 (злокачественные клетки из опухоли мозга), A-1 (клетки амниона человека), МК-2 – из почек обезьяны – всего около 400 видов. Для культур клеток необходимы питательные среды. Наиболее универсальная – 199 среда, содержащая 66 компонентов. Игл установил 28 крайне необходимых компонентов: глютамин, 12 незаменимых аминокислот, 8 витаминов комплекса В, 6 неорганических ионов, углевод, сыворотка. Основу всех сред составляют солевые растворы: Эрла, Хенкса. рН среды должна быть строго определена и постоянна – 7,0-7,4.
- культивирование вирусов в куриных, реже утиных, эмбрионах
Эмбрионы для выделения вирусов применяют с 1930 года. Преимущества: это закрытая полость, свободная от микрофлоры и вирусов. У эмбрионов не образуются антитела, как в организме лабораторных животных, они доступны и дешевы. Используются эмбрионы разного возраста (от 5-7-дневного до 11-13-дневных) и разные методы заражения: в амнион, на хорион-аллантоисную оболочку – ХАО, в хорион-аллантоисную полость, в желточный мешок.
- накопление вируса в организме чувствительных лабораторных животных
В основном используются белые мыши разного возраста, обезьяны (для вируса кори). При накоплении вирусов в организме животных можно оценить этапы развития клинической картины заболевания, патоморфологические и патогистологические изменения в органах и тканях.
2-ой этап – обнаружение (индикация) вирусов:
а) В культуре ткани:
¨ Обнаружение внутриклеточных включений, элементарных телец (см. Экспресс-диагностику)
¨ Обнаружение ЦПД разных вирусов в культуре ткани:
При размножении вируса в культуре ткани происходят различные изменения, которые в конечном итоге приводят к гибели клетки. Сморщивание клеток, пикноз ядер, скручивание их, образование небольших очагов этих изменений наблюдается при энтеровирусной инфекции, полиовирусы тоже дают очень быстро ЦПД. Вирус может размножаться и не вызывать заметных изменений в клетке, тогда прибегают к окрашиванию монослоя гематоксилин-эозином или другим гистохимическим методом и изучают тонкие изменения в ядрах и цитоплазме и т.д.
¨ РГАдс. – реакция гемадсорбции:
Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Если к культуре клеток, зараженной вирусом с ГА, добавить эритроциты, то они могут адсорбироваться на клетках, пораженных вирусом. Данный феномен наблюдается с вирусами клещевого энцефалита, гриппа, парагриппа, кори, паротита и т. д. Учёт реакции проводится с помощью световой микроскопии.
¨ РГА – реакция гемагглютинации:
Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Вирусы, обладающие ГА, способны вызывать склеивание эритроцитов. В отличие от гемадсорбции, для РГА берется вируссодержащая жидкость (ВСЖ) (культуральная среда, амниотическая или аллантоисная жидкость и т.д.), помещается в лунку планшета и добавляется взвесь эритроцитов (куриных, бараньих, человеческих и др.). При наличии в ВСЖ вируса с ГА происходит агглютинация эритроцитов, и они образуют осадок в виде зонтика (РГА положительная); при отсутствии вируса образуется осадок из эритроцитов в виде пуговки (РГА отрицательная).
¨ Цветная проба Солка:
Самый простой метод индикации вирусов в культуре клеток. Сущность его заключается в визуальной оценке окраски питательной культуральной среды. Большинство питательных сред для культур тканей содержит индикатор – феноловый красный. В нейтральной стерильной среде индикатор имеет красный цвет. В кислой среде феноловый красный становится желтым. Жизнеспособные клетки выделяют в питательную среду кислые продукты своего метаболизма, вызывая изменение цвета индикатора с красного на желтый уже на третьи сутки. При накоплении вируса в культуре клеток он нарушает функционирование клеток вплоть до их гибели. При этом отмечается задержка изменения цвета среды более 6 дней, что и позволяет сделать заключение о присутствии вируса в культуре.
б) В куриных эмбрионах:
¨ Образование бляшек на хорион-аллантоисной оболочке
¨ Помутнение амниотической жидкости.
¨ РГА
в) В организме лабораторного животного:
¨ Оценка клинических проявлений инфекции
¨ Оценка патоморфологических и патогистологических изменений
3-ий этап – идентификация вирусов:
Идентификация вируса производится по инактивации его или его свойств специфическими противовирусными сыворотками. Для этого вируссодержащую жидкость (в РТГА, РН, РСК, ИФА) или культуру инфицированных клеток (в РИФ) инкубируют с диагностическими сыворотками, после чего:
а) РТГА:
¨ добавляется взвесь эритроцитов (курицы, человека, барана и др.). При связывании антителами диагностической сыворотки гемагглютининов вируса агглютинации эритроцитов не происходит (образуется осадок эритроцитов в виде пуговки – РТГА положительная). Если сыворотка не подходит к данному вирусу, эритроциты агглютинируются, образуя осадок в виде зонтика.
б) РН с учетом по:
¨ цветной пробе Солка:
если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не может инфицировать и разрушать клетки культуры, что приводит к пожелтению питательной среды (РН положительная). Если сыворотка не подходит к данному вирусу, он поражает клетки культуры, они погибают, и цвет питательной среды остается красным.
¨ нейтрализации ЦПД:
если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не оказывает ЦПД на клетки культуры (РН положительная). Учет проводят микроскопически.
¨ нейтрализации инфекционной активности вируса:
если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не вызывает заболевание у инфицированного лабораторного животного (РН положительная).
¨ РТГАдс:
если вирус связался с антителами дигностической сыворотки, он не вызывает адсорбции (фиксации) эритроцитов на поверхности культуры клеток (РН положительная). Учет проводят микроскопически.
в) РСК
г) ИФА
можно использовать сэндвич-вариант постановки ИФА (см. экспресс-диагностику, только вместо исследуемого материала используют вируссодержащую жидкость).
д) РИФ
культуру клеток, инфицированных вирусом, обрабатывают дигностической люминесцирующей сывороткой и учитывают результат реакции с помощью люминесцентного микроскопа. Если вирус связывается с антителами диагностической сыворотки, наблюдается свечение клеток (РИФ положительна).
III. Серологический метод (серодиагностика) – обнаружение антител к антигенам вирусов в сыворотке крови пациента:
Для серодиагностики вирусных инфекций используют парные сыворотки, взятые с интервалом 10-14 дней. Диагностически значимым является не менее чем 4-х-кратное нарастание титра AT.
1. РТГА, РСК, ИФА, непрямая РИФ (с антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой), РИА с антигенами вирусов или инактивированными вирусными частицами.
2. РН с живыми лабораторными штаммами вируса с учетом по: цветной пробе Солка, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса.
ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ К ЗАНЯТИЮ №13
1. Строение вирусов.
2. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций:
- Экспресс-методы
- Вирусологический метод
- Серологический метод
Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1175 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 |
|