АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Общие молекулярные механизмы проведения сигналов внутрь клетки

В многоклеточном организме ни одна нормальная клетка на стадиях развития «после зиготы» не живет исключительно по своей внутренней программе. Клетки находятся в непрерывном взаимодействии друг с другом. Всякое изменение жизненных процессов в отдельной клетке наступает только по сигналу из внешней для клетки среды. Для восприятия сигналов на внешней мембране клетки (и для некоторых сигналов на внутриклеточных органелах) есть множество специальных молекул, называемых Рц. Сигнальные молекулы химически комплементарны связывающим структурам Рц, и в общем виде их называют лигандами. Лигандами являются все биологически активные вещества — гормоны, цитокины, нейромедиаторы, патогены и продукты взаимодействия патогенов с тканями организма, ЛС. Большинство лигандов сами не проникают в клетку (некоторые, для которых есть внутриклеточные Рц, проникают), они только связывают наружный Рц. И это их единственнеое собственное биологическое свойство. Дальнейшие биологические последствия зависят от характера дифференцировки клетки, на которой экспрессирован Рц для данного лиганда. Связывание Рц изменяет его конфигурацию. Это изменение передается «влево, вправо» по мембране и «вниз» внутрь клетки, что служит началом цепи взаимодействий определённых внутриклеточных молекул — проведения сигнала (рис. 6.1). Проведение сигнала в клетку приводит к тому или иному биологическому эффекту — клеточному проявлению активации/подавления, например:

Рис. 6. 1. Межклеточный «интерфейс» между T–лимфоцитом и АПК. А. Адгезия T–лимфоцита и АПК до распознавания Аг. Эти взаимодействия слабые, и если не произойдет связывания TCR с Аг, то клетки легко диссоциируют. Б. После связывания TCR с комплексом MHC — пептид изменяется конформация молекулы LFA–1 и связь между клетками становится более сильной и продолжительной.

1) изменяются адгезивные свойства клеточной мембраны — клетка становится более «липкой» по отношению к своему окружению или, наоборот, менее «липкой», что позволяет ей начать двигаться (лимфоциты и все лейкоциты);

2) клетка (лимфоциты и все лейкоциты) начинает перемещаться в тканях под действием сигналов (хемотаксис) — сквозь стенку кровеносного сосуда (экстравазация), к очагу повреждения;

3) клетка дегранулирует, выбрасывая в межклеточное пространство депонированные биологически активные вещества (тучные клетки, эозинофилы, базофилы, активированные макрофаги и нейтрофилы, цитотоксические T–лимфоциты и NK);

4) клетка вступает в пролиферацию или наоборот — перестает делиться (в периферических тканях — только лимфоциты);

5) клетка начинает (или прекращает) транскрипцию определённых генов, последующую трансляцию (синтез белка) и секрецию продукта;

6) в клетке включается «программа смерти», развивается апоптоз, и клетка прекращает своё существование.

Экспрессию тех или иных жизненных функций называют активацией клетки, подавление жизненных функций называют подавлением, или супрессией, клетки, а с ней и иммунного ответа. Соответственно существуют активирующие взаимодействия Рц—лиганд и ингибирующие взаимодействия Рц—лиганд. В некоторых случаях можно говорить об активирующих и ингибирующих Рц. Но последняя альтернатива не является строгой. Например, один и тот же TCR в случае, если он свяжет пептид–агонист и произойдут все необходимые корецепторные взаимодействия, создаст сигнал для активации лимфоцита. Но если тот же самый TCR свяжет пептид–антагонист, то активации клетки не будет. Если тот же TCR свяжет пептид-частичный агонист, то в лимфоците будет поддерживаться состояние частичной активации, которое на уровне клетки и организма выглядит как иммунологическая толерантность (см. рис. 6.1).

Исследования закономерностей взаимодействия TCR со своими лигандами показали, что не всякое связывание приводит к активации лимфоцита. Некоторые комплексы пептидов с MHC связываются с TCR, не вызывают активацию лимфоцитов и препятствуют собой связыванию с тем же TCR другого комплекса пептид—MHC, который в отсутствие первого вызывает активацию лимфоцита. Такие ингибирующие пептиды называют пептидами–антагонистами. Пептиды, вызывающие активацию с TCR, называют пептидами–агонистами. Химические исследования показывают, что пептиды–антагонисты получаются при замене в молекулах пептидов–агонистов АК, участвующих в связывании с TCR, при сохранении АК, участвующих в связывании с молекулами MHC. Вероятно, подавление активации лимфоцитов пептидами–антагонистами играет свою роль в патогенезе персистирующих вирусных инфекций. Это показано, например, для ВИЧ–инфекции: мутантные вирусные пептиды–антагонисты способны заблокировать активацию вирусспецифических CD8⁺ ЦТЛ, будучи в количестве в 100 раз меньшем, по сравнению с «нормальными» вирусными пептидами–агонистами, т.е. в каких-то случаях по крайней мере аффинность связи с TCR у пептида–антагониста может превосходить аффинность связи пептида–агониста.

Недавно открыт ещё один вариант взаимодействия пептидов (в комплексе с MHC) с TCR — особым, «третьим» способом: в клетке при этом наступает частичная активация. Такие пептиды назвали частичными агонистами (partial agonists or altered peptide ligands). Частичная активация заключается в неполном фосфорилировании e и z–цепей TCR и подсоединении к Рц неактивной формы киназы ZAP–70. По-видимому, аффинность связи с TCR пептидов–частичных агонистов обычно меньше аффинности связи пептидов–агонистов. Но этот «третий» вариант взаимодействия TCR с Аг представляет особый интерес для фундаментальной иммунологии, так как, вероятно, именно по такому варианту «частичных агонистов» происходит непрерывное распознавание «своего» всеми периферическими лимфоцитами (T и В). Без распознавания «своего» наши лимфоциты в нашем теле не живут (об этом свидетельствуют эксперименты на моделях мышей с трансгенами и нокаутом генов одновременно). Это распознавание защищает их от апоптоза. Но такое распознавание, не приводящее к полноразмерной активации лимфоцита, не приводит и к аутоиммунному повреждению своих тканей в норме.

Биохимические пути проведения сигналов различны для разных категорий Рц и их семейств. Ниже будут рассмотрены следующие категории Рц лимфоцитов и их клеток–партнёров по иммунному ответу (лейкоцитов):

Ú иммунорецепторы (так называют Рц, обеспечивающие непосредственные реакции на Аг, — TCR, BCR, FcR, в последнем случае есть один посредник — растворимые АТ);

Ú TOLL–подобные Рц для микробных продуктов;

Ú Рц семейства 7–членной «гармошки» для медиаторов базовой воспалительной реакции;

Ú Рц для цитокинов.

В настоящее время известно несколько конкретных внутриклеточных реакций, обеспечивающих проведение сигналов. Эти реакции во многом одинаковые для разных пар Рц–лиганд. Внутриклеточные молекулы — участники проведения сигналов — раньше называли вторичными мессенджерами (вторичными посредниками). Чтo определяет специфичность биологических последствий при разных сигналах, в большинстве случаев почти неизвестно — лишь немного, и лишь отчасти. Известны разные вторичные мессенджеры «при» TCR в T–лимфоцитах и BCR в B–лимфоцитах. Известны также разные вторичные мессенджеры при разных Рц — «для Аг», «для цитокинов», «для медиаторов воспаления».

ПРОВЕДЕНИЕ СИГНАЛОВ С РЕЦЕПТОРОВ ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ АНТИГЕНОВ — TCR И BCR

Для Рц лимфоцитов для Аг — TCR и BCR — описан ряд общих закономерностей восприятия и проведения активационных сигналов в клетку (рис. 6.2).

Рис. 6. 2. Взаимодействия внутриклеточных молекул, участвующих в проведении сигналов с рецепторов для антигена (на примере TCR) на ядро (гены) T–лимфоцита (схема). TCRкластеризован — это непременное условие продуктивной активации лимфоцита. CD45 — трансмембранная тирозинфосфатаза, отщепляет ингибирующие фосфаты от ITAM цитоплазматических участков цепей комплекса TCR, чем способствует активации внутриклеточных тирозинкиназ семейства Src (Fyn и Lck). Киназы Src конститутивно ассоциированы с одной стороны с клеточной мембраной, с другой — с проводящими сигнал участками цепей TCR. ZAP–70 — z–associated protein–70 — тирозинкиназа с молекулярной массой 70 кД, ассоциированная с z–цепью комплекса TCR. LAT — один из адапторных белков, связывающих активированную киназу ZAP–70 с киназами Tec, активирующими дальше фосфолипазу C–г (PLCr). PLCr расщепляет фосфатидилинозитолдифосфат клеточной мембраны (PIP₂) на диацилглицерол (ДАГ), который остаётся в мембране, и фосфатидилинозитол трифосфат (PIP₃), который уходит внутрь клетки и участвует в высвобождении Ca²⁺ из депо, участвующих в дальнейших реакциях активации. PKC — протеинкиназа С, которую активирует ДАГ. NFkB — ядерный фактор транскрипции каппа В.NFAT — nuclear factor of activated T–cells — ядерный фактор транскрипции активированных T–лимфоцитов. АP–1–фактор транскрипции — димер генрегулирующих белков Fos и Jun.

· Лиганд(ы) связывают несколько одноимённых Рц в кластеры (кластеризация Рц в мембране). Без кластеризации изменение конформации от «одновалентного» взаимодействия Рц–лиганд количественно недостаточно для наступления последствий на уровне всей клетки*.

Большинство препаратов Аг, используемых в экспериментах, являются мономерными и растворимыми. Однако на практике на них легко удаётся получить гуморальный иммунный ответ — выработку АТ в организме животного. Сами по себе такие Аг, очевидно, не могут вызвать кластеризацию BCR. Поэтому предполагают, что происходит следующее. BCR связывает Аг и наступает опосредованный через Рц эндоцитоз Аг. Внутри клетки Аг расщепляется, и пептидные фрагменты образуют комплексы с молекулами MHC, в таком виде экспрессируются на мембрану. B–лимфоцит начинает выступать в роли АПК для T–лимфоцита. T–лимфоцит связывает кассеты этих комплексов на поверхности B–лимфоцита, между ними формируется иммунологический синапс, и T–лимфоцит посылает B–лимфоциту необходимый для запуска продукции АТ «второй сигнал». Такое представление объясняет механизм давно известной тимусзависимости гуморального иммунного ответа на большинство белковых антигенов.

· Значительная часть биохимических реакций проведения сигнала — фосфорилирование молекул белков по остатку тирозина под действием протеин–тирозинкиназ или дефосфорилирования белков под действием фосфатаз. Изменение статуса остатков тирозина по фосфорилированности приводит к активации или инактивации белка. Процессы фосфорилирования–дефосфорилирования белков легко обратимы, осуществляются без дополнительных синтезов белков и поэтому «удобны» для быстрых и гибких адаптивных реакций клетки на внешние сигналы.

· В цитоплазматических участках сигналпроводящих цепей Рц выявлены определённые последовательности АК, содержащие остатки тирозина. Эти последовательности назвали ITAM (Immunoreceptor Tyrosine–based Activation Motifs — тирозинсодержащие активационные последовательности АК в иммунорецепторах) для активирующих сигналов и ITIM для подавляющих активность клетки сигналов. ITAM содержат 2 остатка тирозина, разделённых 9–12 АК: ...YXX[L/V]X_6–9 YXX[L/V]..., где Y — остаток тирозина, X — остатки разных АК, L — остаток лейцина,V — остаток валина.

à В одном BCR содержится всего две последовательности ITAM — по одной в цитоплазматических концах молекул Iga и Igb. Именно в этих цепях — Iga и Igb — ITAM впервые и идентифицировали. В одном TCR содержится 10 последовательностей ITAM (по 1 в g-, d- и 2 e–цепях, по 3 в каждой из 2 z–цепей).

à Первыми, «обслуживают» TCR/BCR внутри клетки протеин–тирозин киназы семейства Src (читают «сарк»). Эти киназы связаны с внутренней стороной клеточной мембраны через липидные мостики, а также они «заранее» связаны низкоаффинно с ITAMs в цитоплазматических участках цепей Рц. Тирозинкиназы этого семейства характерны для разных сигналов, инициирующих деление и дифференцировку клеток. Название произошло от «вируса саркомы Рауса», потому что изначально эти киназы открыли как продукты онкогена этого вируса (v–src). Затем был открыт клеточный ген–прототип (c–src). Киназы Src фосфорилируют ITAM в цитоплазматических концах цепей Рц. Фосфорилирование по тирозину так меняет молекулу белка, что в ней возникают места, способные связывать другие белки. Запускаются «белок–белковые взаимодействия». Охарактеризованы два варианта мест связывания белков с белками: SÍ2–домен (Srchomology 2) и SÍ3–домен (Src homology 3); SÍ2–домен связывает другие белки по фосфотирозину, SÍ3–домен связывает другие белки по участкам, богатым пролином.

Ú В B–лимфоцитах работают Src–киназы Fyn, Blk и Lyn, а в T–лимфоцитах — Src –киназы Fyn и Lck. В T–лимфоцитах киназа Lck конститутивно ассоциирована с цитоплазматическими доменами корецепторов CD4 и CD8, а киназа Fyn после кластеризации TCR ассоциируется с z и e–цепями.

Ú Ферментативная активность самих киназ семейства Src зависит от фосфорилированности киназного домена и C–концевого участка молекулы: фосфорилирование остатка тирозина в киназном домене приводит фермент в активное состояние, фосфорилирование остатка тирозина в C–концевом участке инактивирует фермент. Фосфорилирование в C–конце осуществляет специальный фермент — киназа Csk. Этa киназа конститутивно активна в неделящихся клетках. Противодействует киназе Csk трансмембранная тирозин–фосфатаза CD45, которая удаляет фосфат с остатка тирозина в C–конце молекул киназ семейства Src. Молекула CD45 была открыта как «общий Аг всех лейкоцитов». Таким образом, от баланса активностей киназы Csk и фосфатазы CD45 зависит, наступит или нет активация лимфоцита после агрегации его Рц для Аг. Через экспрессию разных изоформ фосфатазы CD45 регулируется порог силы сигнала, активирующего T–лимфоцит. В иммунных T–лимфоцитах и T–лимфоцитах памяти экспрессирована изоформа CD45, уже ассоциированная с цепями TCR, и порог активации иммунных T–лимфоцитов существенно ниже, чем у неиммунных T–лимфоцитов, в которых экспрессируется иная изоформа CD45 — не предассоциированная с TCR.

à Второй известный молекулярный механизм регуляции активности киназ семейства Src в клетке — это их ковалентное связывание с убиквитином через адапторный белок Cb1.

Ú Связывание с убиквитином «направляет» всякий белок на деградацию в протеасомах.

Ú Совместная агрегация Рц лимфоцитов для Аг с корецепторами (TCR с CD4 или CD8 и BCR с «CD19, CD21, CD81») значительно снижает порог чувствительности лимфоцита к активации: при наличии корецепторов для активации T–лимфоцита достаточно связать 100 одинаковых комплексов пептид–MHC, в отсутствие корецепторов необходимо не менее 10 тыс. таких комплексов, что в естественных условиях, по-видимому, не встречается. Агрегация BCR с корецепторами «CD19, CD21, CD81» снижает порог чувствительности B–лимфоцита по показателю концентрации Аг в 1000–10 000 раз.

· С фосфорилированными ITAM в цитоплазматических участках цепей Рц начинают взаимодействовать тирозинкиназы следующего этапа проведения сигнала — Syk в B–лимфоцитах и ZAP–70 в T–лимфоцитах. Киназа Syk встречается только в кроветворных клетках, киназа ZAP–70 — только в T–лимфоцитах. Обе эти киназы имеют по два домена SH2 в N–конце молекулы. Киназная активность локализована в C–конце.

à ZAP–70 активируется фосфорилированием ассоциированной с корецепторами T–лимфоцита Src–киназой Lck. Будучи активированной, ZAP–70 фосфорилирует свои субстраты — два адапторных белка LAT и SLP–76 (аналоги в B–лимфоцитах соответственно BLNK и SLP–65). Эти адапторные белки связаны с богатыми холестеролом участками внутренней стороны клеточной мембраны через липидные мостики (пальмитоилированные остатки цистеина). Физическая ассоциация проводящих сигнал компонентов с клеточной мембраной обеспечивает распространение сигнала не только внутрь клетки, но и вдоль мембраны.

· На этом этапе происходит активация киназ ещё одного семейства, встречающегося только в лимфоцитах — это киназы Tec. В B–лимфоцитах экспрессируется киназа Брутона — Btk*, в T–лимфоцитах — киназа Itk. В молекулах этих киназ есть участки, так называемые домены PH (pleckstrin–homology), позволяющие этим белкам связываться с фосфорилированными липидами внутренней стороны клеточной мембраны. Через свои SH2- и SÍ3–домены они связывают адапторные белки LAT, SLP–76, BLNK. Киназы Tec являются важными активаторами следующего участника проведения сигнала — фосфолипазы C–g.

Киназа Брутона Btk (Bruton's tyrosine kinase) — «знаменита» тем, что именно дефект в гене этого фермента обнаружен у пациентов с первичным иммунодефицитом — агаммаглобулинемиейБрутона. Это заболевание — первое, открытое врачами (О.С. Брутоном в 1952 г.) — из категории врождённых генетических иммунодефицитов.

· Молекула фосфолипазы C–g (PLC–g) содержит два домена SH2, через которые она связывается с фосфотирозинами на активированных тирозинкиназах, фосфорилирующих активационные остатки тирозина в молекуле PLC–g. Будучи активированной, PLC–g начинает расщеплять фосфолипиды клеточной мембраны, а именно фосфатидилинозитолдифосфат (PIP₂) на фосфатидилинозитолтрифосфат (PIP₃) и диацилглицерол (ДАГ).

à Для PIP₃ есть Рц в эндоплазматическом ретикулуме, он связывается с PIP₃ и тем самым высвобождает ионы кальция из депо в цитозоль. В процесс активации клетки включаются и кальциевые насосы клеточной мембраны, «подкачивающие» Ca²⁺ из внеклеточной среды. Свободный кальций, будучи в достаточной концентрации, активирует кальцийсвязывающие белки, в том числе кальмодулин, который регулирует активность ряда других белков. В высоких концентрациях Ca²⁺ активирует и серин/треониновую фосфатазу — кальцийнейрин, который дефосфорилирует и тем самым активирует фактор транскрипции NFAT (nuclear factor of activated T cells; несмотря на такое название, этот фактор транскрипции не является специфичным только для T–лимфоцитов).

· ДАГ остаётся в мембране и активирует протеинкиназу С (PKC) — серинтреониновую киназу, которая активирует эволюционно «древний» фактор транскрипции NFkB.

· Следующие участники проведения сигнала — малые G–белки. Это небольшие одноцепочные белки, обладающие свойством связываться с гуанозинтрифосфатом (ГТФ). Первый из открытых малых G–белков — Ras (мол. масса 21 кДа). Он был открыт как непременный участник клеточного деления, консервативный у всех исследованных эукариотических клеток.

à Существенные участники процессов передачи сигнала — так называемые адапторные белки. Это белки, содержащие от 1 до 3 SH2- и SH3–доменов, по которым они связывают другие белки, чем обеспечивают нужные белок–белковые взаимодействия. Одним из лигандов адапторных белков являются факторы замещения гуаниннуклеотидов — GEFs (Guanine–nucleotide ExchangeFactors). Ras в неактивном состоянии содержит ГДФ. GEF из адапторного белка заменяет в Ras ГДФ на ГТФ, чем переводит Ras в активное состояние. Ras, однако, обладает собственной ГТФ–азной активностью и быстро отщепляет третий фосфат, чем возвращает себя в неактивное состояние (самоинактивируется). Описаны мутации в гене Ras, приводящие к замене всего одной АК, но с потерей способности самоинактивироваться. Клетки с таким мутантным геном становятся злокачественно опухолевыми.

à В состоянии кратковременной активации Ras успевает активировать очередной каскад киназ, называемый MAP (Mitogen–Activated Protein Kinase). Именно эти киназы MAP уже непосредственно фосфорилируют факторы транскрипции в адре клетки. В настоящее время охарактеризован фактор транскрипции АP–1 — гетеродимер белков Fos и Jun.

· Изучение внутриклеточных молекулярных механизмов действия таких иммунодепрессивных ЛС, как циклоспорин А, такролимус (FR506) и сиролимус, привело к обнаружению в клетке так называемых иммунофилинов. Иммунофилинами назвали те молекулы в клетке, с которыми указанные иммунодепрессанты вступают в непосредственное химическое взаимодействие: циклоспорин А образует комплекс с иммунофилином, названным циклофилином, такролимус — с иммунофилином FKBP (FK–Binding Protein). Иммунофилины являются ферментами — пептидил–пролил– cis–trans –изомеразами. Биологические эффекты циклоспорина А и такролимуса одинаковы: образующиеся в клетке комплексы «иммунофилин–препарат» связывают и инактивируют кальцийнейрин. В результате не активируется фактор транскрипции NFAT и не наступает транскрипция с генов ИЛ–2, CD40–лиганд, Fas–лиганд и T–лимфоцит не выходит в активацию, не наступает экспансия клона. Кальцийневрин функционирует не только в T–лимфоцитах, но и в других клетках, однако его концентрация в других клетках существенно выше, чем в T–лимфоцитах. Это и позволяет подавить активацию T–лимфоцитов дозами препаратов, к которым устойчивы другие клетки. У сиролимуса иной внутриклеточный механизм действия, чем у циклоспорина и такролимуса. Сиролимус связывается с тем же иммунофилином, что и такролимус, — FKBP, но этот комплекс не затрагивает кальцийнейрин. Комплекс сиролимус—иммунофилин связывается в клетке с некой протеинкиназой, названной mTOR (Mammalian Target Of Rapamycin) и блокирует проведение сигналов с Рц для ИЛ–2, ИЛ–4 и ИЛ–6 — соответственно блокируются пролиферация и иные проявления активации, зависящие от этих Рц.

à То, что у циклоспорина А и такролимуса, с одной стороны, и у сиролимуса — с другой разные внутриклеточные механизмы действия, позволяет использовать их комбинации в клинике с существенным снижением дозы с обеих сторон.

Кратко суммируем «ключевые слова», обозначающие процессы и молекулы, осуществляющие внутриклеточное проведение сигналов в лимфоцитах с Рц для Аг:

Ú кластеризация Рц и корецепторов;

Ú ITAM's — 2 в BCR, 10 в TCR;

Ú киназы семейства Src—Fyn, Blk, Lyn — в B–лимфоцитах, Lck и Fyn в T–лимфоцитах;

Ú киназы Syk и ZAP–70;

Ú киназы семейства Tec—Btk, Itk;

Ú фосфолипаза C–g (PLC–g);

Ú фосфатидилинозитол дифосфат (PIP₂), фосфатидилилинозитол трифосфат (PIP₃), диацилглицерол (ДАГ);

Ú ионы кальция (Ca²⁺), кальмодулин, кальцийнейрин, фактор транскрипции NFAT;

Ú протеинкиназа С (PKC), фактор транскрипции NFkB;

Ú малые G–белки (Ras);

Ú каскад киназ MAP;

Ú факторы транскрипции АP–1;

Ú иммунофилины.

Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 1262 | Нарушение авторских прав