АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Лактобактерии

Систематика. Всвязи с многочисленным количеством видов молочнокислых палочек (67) при их классификации и идентификации выделенных штаммов в последнее время, кроме морфологических особенностей, культуральных свойств и ферментативной активности (фенотипические свойства), учитывают также генотипические особенности: содержание гуанина с цитозином (Г+Ц) в молекуле ДНК, выраженное в мольпроцентах, гомологию ДНК/ДНК различных штаммов и видов, состав и расположение аминокислот межпептидных связей в пептидогликане клеточной стенки (тип пептидогликана) и др.

Представители рода Lactobacterium имеют очень широкие пределы содержания гуанина с цитозином (Г+Ц) в молекуле ДНК, составляющие от 32 до 53 моль %, что является диапазоном в два раза большим чем для обычного отдельного рода.

Наиболее распространенным типом пептидогликана у лактобактерий является тип лизин-Д-аспарагиновая кислота. Реже встречаются другие типы: лизин-аланин (Lbm. confusus, Lbm. fructosus, Lbm. sanfrancisco), лизин-аланин-серин (Lbm. halotolerans, Lbm. viridescens), орнитин-Д-аспарагиновая кислота (Lbm. fermentum) и др.

У некоторых видов лактобактерий в клеточной стенке может присутствовать мезо-диамино-пимелиновая кислота (Lbm. scharpeae, Lbm. vitulinum, Lbm. yamanashiensis, Lbm. agilis, Lbm. maltaromicus, Lbm. plantarum, Lbm. divergens, Lbm. vaccinostercus), что также учитывают при идентификации микроорганизмов.

Молочнокислые палочки (лактобактерий) относят к семейству Lactobacteriaceae, роду Lactobacterium, включающему три (по Орла-Иенсену) подрода: Thermobacterium (термобактерии), Streptobacterium (стрептобактерии) и Betabacterium (бетабактерии). В связи с тем, что молочнокислые палочки спор не образуют и поэтому не являются бациллами, их необходимо относить к роду Lactobacterium, но не к роду Lactobacillus, как часто пишут в специальной литературе.

Для рода Lactobacterium (Lbm.) типичным видом является Lbm. delbrueckii (Leichman, 1896; Bejerinck, 1901).

В «Определителе бактерий Берджи» 44 основных вида (описано еще 23 вида, таксономическое положение которых не установлено) рода лактобактерий распределены в три группы, соответствующие подродовым определениям Орла-Иенсена. К первой группе в подрод Thermobacterium отнесены облигатные гомоферментативные лактобактерий, в подрод Streptobacterium вошла вторая группа, объединяющая факультативные гетероферментативные лактобактерий, третья группа молочнокислых палочек представлена облигатными гетероферментативными лактобактериями, отнесенными к подроду Betabacterium.

Такое деление является в определенной мере условным, так как многие, недавно описанные виды не подходят под характеристики свойств подродов по температуре роста, морфологии и другим особенностям.

В группу I (таблица 8) вошли 15 видов гомоферментативных молочнокислых палочек, которые ферментируют углеводы исключительно до молочной кислоты. В подавляющем большинстве это термофилы, за исключением 4-х видов (Lbm. farciminis, Lbm. amylophilum, Lbm. sharpeae, Lbm. yamanashiensis), которые развиваются при 15 ˚С и не растут при 45 ˚С.

Эта группа объединяет всех классических представителей термобактерий и многие недавно описанные виды. Относительно гомологии ДНК/ДНК, то она содержит два основных комплекса близких видов.

Первый комплекс состоит из трех подвидов Lbm. delbrueckii (таблица 8), которые прежде определялись как четыре самостоятельных вида: Lbm. delbrueckii, Lbm. bulgaricum, Lbm. lactis и Lbm. leischmanii. Было установлено, что эти виды обладают между собой гомологией ДНК/ДНК больше, чем на 80 %, и фенотипические различия их проявляются только при ферментировании углеводов. В связи с этим прежние виды этих лактобактерий были переведены в ранг подвидов.

Второй комплекс гомоферментативных термобактерий представлен Lbm. acidophilum и близко связанных с ним видов - Lbm. gasseri, Lbm. crispatus и Lbm. helveticum.

Во вторую группу (подрод Streptobacterium) отнесены 11 видов факультативных гетероферментативных лактобактерий (табл. 10), которые могут ферментировать углеводы до молочной кислоты или до молочной, уксусной и муравьиной кислот, этилового спирта и других продуктов.

Представители второй группы являются мезофилами, за исключением вида Lbm. agilis, а также подвида Lbm. casei subsp. rhamnosus, которые не растут при 15 ˚С и развиваются при 45 ˚С.

По гомологии ДНК среди стрептобактерий различают три основных комплекса видов или подвидов.

Первый комплекс, сформированный многими штаммами, обозначен как Lbm. plantarum. Внутри этого большого вида имеются штаммы, обладающие свойствами, атипичными для рода лактобактерий, например подвижностью и др.

Большинство вариантов Lbm. plantarum связано с типовым штаммом на уровне гомологии ДНК 80-100 %, четверть штаммов имеют гомологию ДНК на уровне 30-70 %, что указывает на существование Дополнительных генотипов Lbm. plantarum.

Второй комплекс стрептобактерий сформирован тремя подвидами Lbm. casei (всего имеет 4 подвида): Lbm. casei subsp. casei, Lbm. casei subsp. pseudoplantarum и Lbm.casei subsp. tolerans. Они образуют генотип на уровне гомологии ДНК 80-100 % по отношению друг к другу и 40 % гомологии к генотипу типового штамма.

Штаммы 4-го подвида Lbm. casei subsp. rhamnosus представляют отдельный генотип, который гомологичен только на 30-50 % со штаммами других подвидов. В связи с этим подвид Lbm.casei subsp. rhamnosus может быть выделен в самостоятельный вид.

Третий комплекс видов стрептобактерий состоит из Lbm. sake, Lbm. curvatus и Lbm. bavaricus. Первые два вида связаны на уровне гомологии ДНК/ДНК 50 %.

Lbm. bavaricus фенотипически отличается от первых двух видов. Большинство штаммов показывают 100%-ную гомологию ДНК/ДНК к Lbm. sake, несколько штаммов гомологичны с Lbm. curvatus. Это указывает на то, что вид Lbm. bavaricus состоит из двух генотипов, один из которых, включая типовой штамм, может рассматриваться как подвид Lbm. sake, другой - как подвид Lbm. curvatus.

Третья группа лактобактерий объединяет 18 видов облигатных гетероферментативных лактобактерий (табл. 12), которые ферментируют углеводы до молочной и уксусной кислот, этанола и СО2. По отношению к температуре они являются мезофилами, за исключением трех видов -Lbm. fermentum, Lbm. reuteri, иногда Lbm. confusus, которые растут при 45 ˚С и не культивируются при 15 ˚С.

В эту группу входят все облигатные гетероферментативные лактобактерий, отнесенные к подроду Betabacterium. Исключение составляет Lbm. bifermentans, который ферментирует глюкозу гомоферментативно до L-молочной кислоты, но в зависимости от рН образуемая молочная кислота может расщепляться до уксусной кислоты, СО2 и даже Н2.

Большинство видов третьей группы имеют очень узкий диапазон Г+Ц в ДНК (40-46 моль %).

Однако, по отношению друг к другу они не ■ показывают значительную гомологию ДНК/ДНК. Исключение составляют Lbm. kefir и Lbm. buchneri, имеющие гомологию ДНК/ДНК 40 %.

В третьей группе имеются виды лактобактерий, у которых характерный для лактобактерий тип пептидогликана лизин-Д-аспарагиновая кислота заменен на тип лизин-аланин или другие, типичные для представителей рода Leuconostoc. В связи с этим Lbm. confusus был первоначально ошибочно отнесен к роду Leuconostoc, чему способствовали также его коккоподобная форма и способность образовывать слизь.

Морфологические свойства. Лактобактерий представляют собой палочки размером 4-15 х 0,5-0,6 мкм, встречаются изогнутые и булавовидные формы (коринеформы), также короткие коккобактерии. Они, как правило, неподвижны, спор и капсул не образуют, по Грамму красятся положительно.

 

Рисунок 21 ‑ Молочнокислые бактерии: а - Lactobacterium bulgaricum; 6 - Lactobacterium casei; в - Lactobacterium acidophilum и Streptococcus thermophilus: клетки, окруженные небольшим слоем слизи

 

Подвижностью обладают два представителя второй группы (Lbm. agilis, Lbm. curvatus) и три вида термобактерий -Lbm. ruminis, Lbm. salivarius и Lbm. jamanashiensis. Все они являются перитрихами. Клетки стрептобактерий мельче, чем клетки термобактерий, часто располагаются в виде цепочек. Бетабактерии имеют наиболее мелкие и тонкие клетки (рис. 21-25).

Образование цепочек обусловлено тем, что деление клеток происходит только в одной плоскости, оно характерно для определенных видов и даже штаммов. Интенсивность образования цепочек зависит от фазы роста и рН среды. Ассиметричное развитие и деление клеток приводят к образованию цепочек, располагающихся по кругу.

Формирование инволюционных (измененных) форм клеток может наблюдаться при симбиотическом росте, например, в кефирных зернах; под воздействием высокой концентрации глицина, D-аминокислот или антибиотиков, активно действующих на клеточную стенку.

Особенности морфологии различных видов лактобактерий представлены в таблицах 8,10,12.

Культуральные свойства. Молочнокислые палочки являются факультативными анаэробами или микроаэрофилами, лучше растут при пониженном содержании кислорода или в атмосфере, содержащей 5-10 % СО2. Некоторые штаммы при выделении являются анаэробами. По отношению к температуре стрептобактерий и бетабактерии являются мезофилами, термобактерии- термофилами.

Лактобактерий относятся к хемоорганотрофам. На обычных средах они не растут, их выращивают на средах с молоком. При развитии в молоке вызывают образование однородного плотного сгустка с приятным кисломолочным запахом и вкусом.

При росте молочнокислых бактерий в жидких средах (гидролизованное молоко) наблюдаются помутнение среды, осаждение

 

Таблица 8 ‑ Дифференцирующие особенности биологических свойств облигатных гомоферментативных видов лактобактерий подрода Thermobacterium

(группа 1)

 

Виды и подвиды Происхож­дение названия Особенности биологических свойств Содержание гуанина + цитозина в молекуле ДНК (моль %). Гомология ДНК/ДНК других видов Кем выделен, когда, источник выделения
* 1. Lactobacterium (Lbm) delbrueckii (Лактобактериум (Л.) дельбруески) Назван по имени Delbruecki - немецкого бактериолога Палочки с закругленными концами, 0,5-0,8 - 2-9 мкм. Образует D-изомер молочной кислоты. Факторы роста: пантотеновая кислота, ниацин, рибофлавин, фолиевая кислота, витамин В12, тимидин 49-51 Leichtnann, 1896; Beijerinck 1901; из растений
la. Lbm. delbrueckii subsp. delbrueckii (Л. дельбруески субспециес (подвид) дельбруески)   Ферментирует углеводы при высоких температурах (40-53°С), большинство штаммов (до 89%) образует аммиак из аргинина 49-51 Leichmann, 1896; выделен из растительного материала
1в. Lbm. delbrueckii subsp. bulgaricum (Л. дельбруески субспециес булгарикум) Bulgaricum -болгарский Обладает слабовыраженной сахаролитической активностью, ферментирует только лактозу, глюкозу, фруктозу. Не образует аммиак из аргинина 49-51 Orla- Jensen, 1919; из йогурта и сыра
lc Lbm. delbrueckii subsp. lactis (Л. дельбруески субспециес лактис) Lactis - из молока (мо­лочный) Большинство штаммов (до 89%) образует аммиак из аргинина 49-51 Orla-Jensen, 1919; из молока, сы­ра, прессован­ных дрожжей и злакового сус­ла
2. Lbm. acidophilum (Л. ацидофилюм) Acidophilum - любящий кислоту (acidus - кислота; philum - любящий) Палочки с закругленными концами, 0,6-0,9 - 1.5-6 мкм. Ферментирует крахмал, образует DL-изомеры молочной кислоты. Факторы роста: фолиевая кислота, ниацин, рибофлавин, пантотенат кальция 32-37; Lbm.gasseri, Lbm. helveticum, Lbm. crispatus (20-50%); Lbm. amylovorum Мою, 1900; из кишечника, ротовой полости человека и животных, вагины
3. Lbm. amylophilum (Л. амилофилюм) Amylum-крахмал, philum - любящий; amylophilum -любящий крахмал Тонкие палочки, 0,5-0,7 - 2-3 мкм. Образует L-изомер молочной кислоты. Факторы роста: рибофлавин, пиридоксаль, пантотеновая кислота, ниацин, фолиевая кислота 44-46 Nakamura, Orowell, 1981; из забродив­ших зерновых фекалий свиней
4. Lbm. amylovorum (Л. амиловорум) Amylum крахмал, vorare - уничтожать; amylovorum - разрушающий крахмал Палочки, 1 - 3-5 мкм. Образует DL-изомеры молочной кислоты. Ферментирует крахмал. Факторы роста: ниацин, пантотеновая кислота, фолиевая кислота, рибофлавин 40-41 Nakamura, 1981; из забродивших зерновых фекалий крупного рогатого скота (КРС)
5. Lbm. animalis (Л. анималис) Animalis – от животного Палочки с закругленными концами, 1,0-1,2 - 3-6 мкм. Образует L-изомер молочной кислоты 41-44; Lbm. murinus Dent, Williams, 1982; из зубного налета и пищеварительного канала животных
6. Lbm. crispatus (Л. криспатус) Crispatus - виться, завиваться Палочки прямые или слегка изогнутые (извитые), 0,8-1,6 - 2,3-11 мкм. Образует DL-изомеры молочной кислоты 35-38; Lbm. acidophilum, Lbm. gasseri, Lbm. amylovorum Brygoo, Aladame, 1953; из фекалий, вагины, щечного кармана человека; у цыплят - из зоба и слепой кишки
7. Lbm. farciminis (Л. фарциминис) Farcimen - колбаса, сосиска Тонкие палочки, 0,6-0,8 - 2-6 мкм. Растет в присутствии 10% NaCl. Образует ЦО)-изомеры молочной кислоты 34-36; Lbm. alimentaris 26-28% Reuter, 1983; из сырых колбас (сосисок) и кислого теста
8. Lbm. gasseri (Л. газери) По имени Gasser - французского бактериолога Палочки с закругленными концами, 0,6-0,8 - 3-5 мкм. Ферментирует крахмал, образует DL- изомеры молочной кислоты 33-35; Lbm. acidophilum, Lbm. crispatus, Lbm. amylovorum Lauer, Kandler, 1980; из ротовой полости, вагины человека; из кишечного тракта людей и животных
9. Lbm. helveticum (Л. хельветикум) Helveticum - швейцарский Палочки одиночные или соединенные попарно, 4 - 0,5-0,6 мкм. Максимальная температура развития 50-52'С. Образует DL - изомеры молочной кислоты. Факторы роста: пантотенат кальция, ниацин, рибофлавин, пиридоксаль 37-40; Lbm. Acidophilum 13-44% Orla- Jensen, 1919; из кислого молока, сырных заквасок, сыров эмментальского и грюйера (швейцарский сыр с за пахом орехов)
10. Lbm. jensenii (Л. иеисени) Назван по имени Orla-Jensen - датского микробиолога Палочки с закругленными концами, 0,6-0,8 - 2-4 мкм. Образует аммиак из аргинина и D-изомер молочной кислоты 35-37 Gasser, Mandel, Rogosa, 1970; из вагинальных выделений человека
11. Lbm. ruminis (Л. руминис) Rumen - рубец, из рубца Палочки с закругленными концами, 0,6-0,8 - 2-4 мкм, иногда подвижен, перитрих; растет при сниженном давлении О2, образует L-изомер молочной кислоты. Фактор роста: цистеин 44-47 Sharpeae, Latham и др., 1973; из рубца крупного рогатого скота (КРС), из нечистот
12. Lbm..salivarius (Л. саливариус) Salivarius - из слюны Палочки, 0,6-0,8 - 3-5 мкм, иногда подвижен, перитрих. Образует L-изомер молочной кислоты 34-36 Rogosa, Wiseman и др., 1953; из ротовой полости и кишечного тракта че­ловека и хомяка, кишечника цыплят
12a. Lbm..salivarius subsp. salivarius (Л. саливариус субспециес саливариус)   Ферментирует рамнозу, не ферментирует салицин и эскулин 34-36 Тоже о
12b. Lbm..salivarius subsp. salicinius (Л. са­ливариус субслециес салициниус) Salicinius -имеет отношение к са­лицину Ферментирует салицин и эускулин, не ферментирует рамнозу 34-36 Тоже
13. Lbm. sharреае (Л. шарпе) Назван по имени Elisabeth Sharpeae - английского бактериолога Палочки с закругленными концами, 0,6-0,8 - 3-8 мкм. Образует L-изомер молочной кислоты   Weiss, Schillinger и др., 1982; из городских нечистот
14. Lbm. vituiinum (Л. витулинум) Vitulinum -от теленка Палочки с закругленными кон­цами, 0,5-0,7 - 2-4 мкм. Поверхностный рост на пита­тельных средах достигается в анаэробных условиях, в свежем МРС-бульоне растет с добавлением 0,05% хлористоводородного цистеина. Образует D-изомер молочной кислоты. 34-37 Sharpeae, Latham и др., 1973; из рубца крыс
15. Lbm. yamanashiensis (Л..яманачиензис) От Yamanashi - назва­ние японской префектуры Палочки, 0,6-0,8 - 2-4 мкм, вяло подвижен, перитрих. Образует L-изомер молочной кислоты 32-34 Nonomura, 1983; из винного сусла и сидра

* Номера видов и подвидов приведены в соответствии с «Определителем бактерий» Берджи.

клеток вскоре после прекращения роста. Осадок однородный и гомогенный, редко зернистый или слизистый. Поверхностная пленка никогда не образуется.

На плотных питательных средах (агар с гидролизованным молоком и мелом, МРС-агар, селективная среда ЛС) лактобактерии формируют округлые мелкие, размером 2-5 мм, гладкие блестящие колонии серо-белого цвета со сферической поверхностью. На гидролизованном агаре с мелом вокруг колоний образуется зона просветления мела. Колонии лактобактерии разных видов почти не различаются. Однако в некоторых случаях наблюдаются колонии шероховатые, волокнистые, врастающие в субстрат. Эти колонии с шероховатым краем относятся к R-формам в отличие от гладких колоний, относящихся к S-формам (рисунки 22,23,24,25).

Глубинные колонии термобактерий могут быть темными, желтовато-бурыми, иногда с короткими отходящими нитями. В отличие от глубинных поверхностные колонии более крупные, локонообразные или зернистые. Глубинные колонии стрептобактерий имеют лодочкообразную форму, иногда с. выростом. Слизистые колонии образует один вид - Lbm. confusus.

Температурные границы роста для термобактерий составляют 20-55 °С, для мезофилов - 15-38 °С. Оптимальной температурой развития для Lbm. helveticum является 40 °С, для Lbm. delbrueckii subsp. bulgaricum, Lbm. delbrueckii subsp. lactis - 40-45 °C, Lbm. acidophilum -37-38 °С. Для Lbm. helveticum максимальной температурой развития является 50-52 °С. Lbm. delbrueckii subsp. delbrueckii развивается и ферментирует углеводы при температурах 48-53 °C. Для мезофилов оптимальной является температура 30 °C. Виды Lbm. curvatus и Lbm. sake, относящиеся ко 2-й группе, могут размножаться при 2-4 °С.

Оптимальная рН составляет 5,5-6,2. Скорость роста снижается при нейтральной и слабощелочной реакции. Лактобактерии лучше растут в немного подкисленных средах с начальной рН 6,4. Рост прекращается при достижении рН 3,6-4,0.

Лактобактерии являются ауксотрофными организмами и поэтому чрезвычайно требовательны к питательным средам. Они адаптировались к комплексным органическим субстратам и им необходимо для своего развития не только углеводный источник, но также и нуклеотиды, аминокислоты и витамины. Наиболее часто для роста требуется рибофлавин, потребность в фолиевой кислоте, фосфате пиридоксаля и р-аминобензойной кислоте разнообразна для различных видов. Биотин и витамин В12 необходимы только для нескольких видов (см. таблицы 8,10,12).

Многие ростовые вещества введены в широко используемую МРС-среду, предложенную Де Меном и другими соавторами в 1960 г.

В состав МРС-агара входят: пептон из казеина - 10,0 г; мясной экстракт - 10,0г; дрожжевой экстракт - 5,0 г; глюкоза - 20,0 г; К2НРО4 -5,0 г; диаммониум цитрат - 2,0 г; ацетат Na - 5,0 г; MgSO4 x 7Н2О - 5,0 г; MnSO4 х 4Н2О - 0,2 г; твин-80 - 1,0 г; агар - 15,0 г; дистиллированная вода - 1000 см3. Устанавливают рН 6,2-6,4 и стерилизуют при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Состав МРС-бульона - такой же, за исключением агара.

При выделении лактобактерии из различных источников успешно используют селективную ацетатную среду СЛ, предложенную Рогоза с соавторами в 1951 г. В ее состав входят: пептон из казеина - 10,0 г; К2НРО4 - 6,0 г; диаммониум цитрат - 2,0 г; MgSO4 х 7Н2О - 0,5 г; MnSO4 x 4Н2О - 0,2 г; FeSO4 х 7Н2О - 0,04 г; твин-80 - 1,0 г; глюкоза - 20,0 г; ацетат Na х ЗН2О - 25,0 г; агар - 15,0 г. Агар растворяют отдельно на водяной бане в 500 см3 дистиллированной воды, все другие ингредиенты растворяют без нагревания в 500 см3 дистиллированной воды, доводят рН с помощью кристаллической уксусной кислоты до 5,4; добавляют этот раствор к расплавленному агару и кипятят в течение 5 мин. В дальнейшей стерилизации нет необходимости.

Биохимические свойства. Лактобактерий находятся на границе аэробного и анаэробного типов дыхания. Они обладают эффективным метаболизмом ферментации углеводов и аминокислот, который связан с субстратным фосфорилированием, т.е. ферментативным присоединением фосфата к органическому веществу. Вторым уровнем фосфориляции является преобразование карбамидфосфата в СО2 и NH3. Заключительным этапом фосфорилирования является ферментация аргинина, наблюдаемая у большинства гетероферментативных лактобактерий. Однако, только некоторые виды, образующие аммиак из аргинина, способны расти на аргинине как единственном источнике энергии.

 

Таблица 10. Дифференцирующие особенности биологических свойств факультативных гетероферментативных видов лактобактерий подрода Streptobacterium

(группа 2)

Виды и подвиды Происхождение названия Особенности биологических свойств Содержание гуанина + цитозина в молекуле ДНК (моль %). Гомология ДНК/ДНК других видов Кем выделен, когда, источник выделения
16. * Lbm. agilis (Л. агилис) Agilis- подвижный, активный Палочки с закругленными концами, 0,7-1,0 - 3-6 мкм. Подвижен, перитрих. Образует L-изомер молочной кислоты 43-44; Lbm. Plantarum var. mobilis Weiss, Schillinger и др., 1982; из городских нечистот
17. Lbm. alimentaris (Л.алиментарис) Alimentaris- имеющий отношение к пище Короткие тонкие палочки, 0,6- 0,8 - 1,5-2,5 мкм. Образует L(D)- изомеры молочной кислоты. Развивается в средах, содержащих 10% NaCl 36-37; Lbm. farciminis Reuter, 1983; из маринованных рыбных продуктов, сырых колбас и кислого теста
18. Lbm bavaricus (Л. аварикус) Bavaricus баварский Палочки с закругленными концами, изогнутые в стационарной фазе роста, 0,8-1,0 - 2-7 мкм. Температурные пределы роста 2- 37 ˚С. Образует L-изомер молочной кислоты 41-43; Lbm. sake, Lbm. curvatus 80-95% Stetter, Stetter, 1980; из кислой капусты и капустных заквасок
19. Lbm. casei (Л. казеи) Casei - из сыра Палочки, 0,7-1,1 - 2-4 мкм, концы прямоугольные, располагаются чаще в цепочках. Не растет при 45˚С, кроме подвида L. casei subsp. rhamnosus. Образует L-изомер молочной кислоты. Факторы роста: рибофлавин, фолиевая кислота, пантотенат кальция, ниацин, пиридоксаль 45-47; Orla- Jensen, 1916; из молока, молочных продуктов, сыра, кислого теста, навоза КРС, силоса; кишечника, ротовой полости, вагины человека; из сточных вод (нечистот)
19a. Lbm. casei subsp casei (Л. казеи субспециес казеи)   В этот подвид включен лактозоотрицательный вариант, который прежде называли L. casei subsp. alactosus   Orla-Jensen, 1916;
19в. Lbm. casei subsp pseudoplantarum (Л. казеи субспециес псевдоплантарум) Pseudos - ложный, т.е. не является L. plantarum Образует DL-изомеры молочной кислоты   Abo-Elnaga, Kandler,
19с Lb. casei subsp. rhamnosus (Л. Казеи субспециес рамнозус) Rhamnosus - имеющий отношение к рамнозе Хорошо растет при 15 и 45 ˚С, является только гомоферментативным видом   Hansen, 1968
I9d. Lbm. casei subsp. tolerans (Л. казеи субспециес толеранс) Tolerans -толерантный, выносливый Выдерживает нагревание 72 'С в течение 40 с, ферментирует очень узкий спектр углеводов: лактозу, глюкозу, галактозу, фруктозу   Abo-Elnaga, Kandler, 1965
20. Lbm. coryniformis (Л. кориниформис) Coryne - булава, клюшка, formis -форма; согуnifotmis - булавовидный Короткие палочки, часто кокковидной и грушевидной формы, 0,8-1,1 - 1-3 мкм. Факторы роста: пантотеновая кислота, ниацин, рибофлавин, биотип, р-аминобензойная кислота   Abo-Elnaga, Kandler, 1965; из силоса, навоза KPC, из воздуха коровника и сточных вод
20а. Lbm. соryniformis subsp. corinyniformis (Л. кориниформис субспециес кориниформис)   Продуцирует D (L)- изомеры молочной кислоты. L-изомер образуется в количестве 15-20% от обшей молочной кислоты   Abo-Elnaga, Kandler, 1965
20в. Lbm. соryniformis subsp. torquens (Л. кориниформис субспециес торквенс) Torquens -изогнутый, искаженный Продуцирует исключительно D-изомер молочной кислоты   Abo-Elnaga, Kandler, 1965
21. Lbm. curvatus (Л. курватус) Curvate - лат. изогнутый, искривленный Палочки, изогнутые в форме бобов, 0,7-0,9 - 1-2 мкм, встречаются в парах, коротких цепочках, образуют кольца из 4-клеток или располагаются в форме подковы. Иногда подвижны. Может расти при 2-4'С. Продуцирует DL-изомеры молочной кислоты. 42-44; Lbm. sake 40-50% Troili-Peterson, 1903; из навоза КРС, молока, силоса, готового теста, мясных продук­тов
22. Lbm. homohiochii (Л. гомохиохии) Homos - гр. подобный, hiochi - испорченная японская рисовая водка (саке), homo-hiochi - подобный молочнокислым бактериям, но выделен из саке Палочки с закругленными концами, 0,7-0,8 - 2-6 мкм. Не растет на МРС-бульоне. Оптимум роста 30*С. Лаг-фаза 4-7 дней. Образует D- и L-изомеры молочной кислоты в равных количествах. Устойчив к 13-15%-ному этанолу, который стимулирует рост. Факторы роста: D-мевалоновая кислота 35-38; Lbm. sake 10% и более Kitahara, Kaneko, Goto, 1957; из испорченной японской рисовой водки -саке.
23. Lbm. maltaromicus (Л. мальтаромикус) Malte - высушенные перемолотые отростки ячменя, aroma -приятный запах, maltaromicus - продуцирующий солодоподобный аромат Тонкие палочки различной длины с тенденцией к образованию нитей и длинных цепочек. Продуцирует L(+)-изомер молочной кислоты. Факторы роста: рибофлавин, фолиевая кислота   Miller, Morgan, Libbey, 1974; из производственных молочных образцов, обладающих солодовым привкусом
24. Lbm. murinus (Л. муринус) Murinus - от мышей Палочки с закругленными концами, 0,8-1 - 2-4 мкм, часто в цепочках. Образует L-изомер молочной кислоты. Фактор роста: рибофлавин 43-44 Hemme, Raibaud и др., 1982; из кишечника мышей и крыс
25. Lbm. plantarum (Л. плантарум) Planta - отросток, растение; plantarum - от растений Палочки прямые, 0,9-1,2 3-8 мкм. Некоторые штаммы продуцируют нитрат, рН при этом сдвигается к 6,0 или выше. Образует D- и L-изомеры молочной кислоты. Факторы роста: пантотенат кальция, ниацин 44-46 Orla-Jensen, 1919; из молочных продуктов, силоса, кислой капусты, соленых (маринованных) овощей, кислого теста, навоза КРС, сточных вод, ротовой полости, кишечника, испражнений человека
26. Lbm. sake (Л. саке) Sake - японское рисовое вино (водка) Палочки с закругленными концами, 0,6-0,8 х 2-3 мкм. Многие штаммы растут при 2-4"С. Продуцирует L и D изомеры молочной кислоты 42-44; Lbm. curvatus, Lbm. bavaricus 40-50%; Lbm. homohiochii Katagiri, Kitahara, Fukami, 1934; из закваски саке, кислой капусты, мясных продуктов, готового теста
           

* Номера видов и подвидов приведены в соответствии с «Определителем бактерий» Берджи.

 

В дополнение к субстратному уровню фосфориляции энергия может быть получена при биологическом окислении органических веществ путем дегидрогенирования.

При гомоферментативном метаболизме 1 моль гексозы преобразуется в 2 моля молочной кислоты, при гетероферментативном брожении образуется 1 моль СО2, 1 моль этилового спирта (или уксусной кислоты) и 1 моль молочной кислоты.

Активность ферментации гомо- и гетероферментативных лактобактерии отличается наличием или отсутствием ферментов альдолаз и фосфокетолаз. Гетероферментативные лактобактерии обладают фосфокетолазами, а гомоферментативные виды - альдолазами. В связи с этим гомоферментативные молочнокислые палочки не способны ферментировать пентозы, которые гетероферментативные лактобактерии расщепляют при помощи фосфокетолаз до молочной и уксусной кислот.

Стрептобактерии способны ферментировать пентозы гетероферментативно до молочной и уксусной кислот, в то время как гексозы они метаболизируют гомоферментативно, Поэтому стрептобактерии относят к факультативным гетероферментативным лактобактериям.

Некоторые органические кислоты (лимонная, винная, яблочная) расщепляются стрептобактериями до СО2 и молочной или уксусной кислот.

Отдельные аминокислоты (тирозин и глутаминовая кислота) декарбоксилируются лактобактериями, однако, продукты декарбоксилирования дальнейшему метаболизму не подвергаются.

В процессе ферментации углеводов образуется молочная кислота в форме L- или D-изомеров.

Изомеры молочной кислоты образуются различными путями метаболистической ферментации в зависимости от того, обладает ли L- или D-конфигурацией специфический фермент - лактатдегидрогеназа, продуцирующий специфическую молочную кислоту.

Лактатдегидрогеназы различных видов молочнокислых бактерий отличаются друг от друга электрофоретической (при электрофорезе) подвижностью и кинетическими свойствами. Ионы Мп2+ и некоторые Другие вещества (фруктозо - 1,6 - дифосфат) оказывают на эти ферменты стимулирующее действие.

Многие лактобактерии обладают хорошо выраженными сахаролитическими свойствами (таблицы 9,11,13). Кроме глюкозы и лактозы, многие гомо- и гетероферментативные виды (Lbm. plantarum, Lbm. brevis и др.) интенсивно используют пентозы, иногда даже активнее, чем глюкозу (метаболизм бродильного типа).

 

Таблица 12 ‑ Дифференцирующие особенности биологических свойств облигатных гетероферментативных видов лактобактерий подрода Betabacterium

(группа 3)

 

Виды и подвиды Происхождение названия Особенности биологических свойств Содержание гуанина + цитозина в молекуле ДНК (моль %). Гомология ДНК/ДНК других видов Кем выделен, когда, источник выделения
27. * Lbm. bifermentans (Л. бифсрментанс)   Bis - дважды, fermentalis -заквасывающие; bifermentans дважды ферментирующий Палочки с закругленными или коническими концами, 0,5-1 -1,5-2 мкм. Образует DL-изомеры молочной кислоты. При рН больше 4,0 молочная кислота ферментируется до уксусной кислоты, этанола, СО2 и Н2О. Ферментирует лактаты и продуцирует свободный Н2. Не образует аммиак из аргинина.   Kandler, Schillinger, Weiss, 1983; из испорченного эдамского сыра и новозеландского мягкого сыра гауда, где он образует нежелательные небольшие трещины
28. Lbm. bгеvis (Л. бревис) Brevis короткий Палочки с закругленными кон­цами, 0,7-1 - 2-4 мкм. Образует DL-изомеры молочной кислоты и аммиак из аргинина. Факторы роста: пантотенат кальция, ниацин, тиамин, фолиевая кислота. 44-47; Lbm. hilgardii, Lbm. kefir, Lbm. confusus Lbm. collinoides Orla-Jensen, 1919; из молока, сыра, кислой капусты, кислого теста, силоса, навоза КРС, ротовой полости, кишечника, фекалий человека и крыс
29. Lbm. buchneri (Л. бухнери) Назван именем Е. Buchner - германского бактериолога Палочки с закругленными кон­цами, 0,7-1 - 2-4 мкм. Фермен­тирует мелицитозу, образует DL-изомеры молочной кислоты и аммиак из аргинина. 44-46 Henneberg, 1903; из молока, сыра, растительного материала, подвергшегося брожению, ротовой полости человека
30. Lbm. collinoides (Л. коллиноидее) Collins - бугристый, холмистый; idus - форма; collinoides - бугристой формы (колонии) Палочки с закругленными кон­цами, 0,6-0,8 - 3-5 мкм, часто образует длинные нити. Образует DL-изомеры молочной кислоты, а также аммиак из аргинина.   Сагг, Davies, 1972; из сидра (слабоалкогольное вино, полученное брожением яблочного сока и насыщенное углекислым газом; содержит спирта 5-7 объемных %)
31. Lbm. confusus (Л. конфузус) Confusus перепутанный. Ссылка на действительную путаницу этого вида с Leuconostoc Палочки, 0,8-1 - 1,5-3 мкм, часто утолщаются с одного конца. Образует DL-изомеры молочной кислоты, а также аммиак из аргинина. Из сахарозы продуци­рует декстран. 45-47 Halzapfel, Kandler, 1969; из сахарного тростника, морковного сока, редко обнаруживается в сыром молоке, слюне, сточных водах
32. Lbm. divergens (Л. дивергенс) Divergens -отклоняющийся (расходящийся) от нормы или стандарта Палочки с закругленными кон­цами, 0,5-0,7 - 1-1,5 мкм. Слабо продуцирует газ из-за недостатка фактора роста, который до сих пор не установлен, он содержится в пептоне соевых бобов и некоторых дрожжевых пастовых препаратах. Образует L-изомер молочной кислоты и аммиак из аргинина 33-35 Holzapfel, Gerber, 1984; из вакуум упакованного, замороженного мяса
33.Lbm. ferentum (Л.ферментум) Fermentum -фермент, закваска (дрожжи). Палочки толстые, вариабельные, 0,5-0,9 мкм. Образует DL-изомеры молочной кислоты и аммиак из аргинина. Факторы роста: пантотенат кальция, ниацин, тиамин 52-54; L. cellobiosum до 9%, поэтому он рассматривается как биовар L. fermentum Bejerinck, 1901; из закваски (дрожжей), молочных продуктов, кислого теста, бродящего растительного материала, сточных вод, ротовой полости и фекалий человека
34. Lbm. fructivorans (Л. фруктиворанс) Fructus -фрукт; vorare - поедать; fructivorans -поедающий фрукт (в значении фруктопоглощающий) Палочки с закругленными концами, 0,5-0,8 - 1,5-4 мкм. Кислотолюбивый, оптимальная рН 5,0-5,5. При начальной рН выше 6,0 не растет. Образует D(L)-изомеры молочной кис­лоты и аммиак из аргинина. Факторы роста: при выделении из источника - ливалоновая кислота, томатный сок, этанол 38-40 Charlton, Nelson, Werkman, 1934; из испорченного майонеза, уксусных консервов, из испорченной саке, десертного вина, аперитивов (франц. aperitif -напиток для возбуждения аппетита, обычно спиртной)
35. Lbm. fructosus (Л. фруктозус) Fructosus - от фруктозы, имеющий отношение к фруктозе Палочки, 0,5-0,8 - 2-4 мкм. Рост на МРС-бульоне улучшается, если глюкоза заменяется на фруктозу. Образует D(L)-изомеры молочной кислоты, не образует аммиак из аргинина   Kodama, 1956; выделен из цветов
36. Lbm. halotolerans (Л. галотолсранс) Hals - соль; tolerans -выносливый (толерантный), терпеливый; halo-tolerans - солевыносливый (толерантный) Палочки короткие, коккоподобные, с заостренными (сужающимися) концами, 0,5-0,7 -1-3 мкм, иногда образуют цепочки. Хорошо ростет в присутствии 12% NaCl и очень слабо при 14%. Образует DL-изомеры молочной кислоты и аммиак из аргинина   Kandler, Schillinger, Weiss, 1983; из мясных продуктов
37. Lbm. hilgardii (Л.хильгардии)   Палочки с закругленными кон­цами, 0,5-0,8 - 2-4 мкм, одиноч­ные, в коротких цепочках, часто длинные нити. Первоначальная рН для роста и ферментации углеводов 4,5-5,5. Растет в присутствии 15-18% этанола. Образует LD-изомеры молоч­ной кислоты и аммиак из аргинина 39-41; L. brevis, L. reuteri Douglas, Cruess, 1936; первоначально выделен из калифорнийских столовых вин, выделяется и из других вин
38. Lbm. kandleri (Л. кандлери) Назван именем Kandlcr -немецкого биолога Палочки неправильной формы, 0,7-0,8 - 1-5 мкм. Продуцирует слизь из сахарозы. Образует DL-изомеры молочной кислоты и аммиак из аргинина.   Holzapfel, van Wyk, 1983; выделен из пустынного источника
39.Lbm. kefir (Л. кефир) Kefir - кавказское кислое молоко Палочки с закругленными кон­цами, 0,6-0,8 - 3,0-15 мкм. Образует DL-изомеры молочной кислоты и аммиак из аргинина. 41-42; L. buchneri (до 40%) Kandler, Kunath, 1983; из кефирных зерен и питьевого кефира
40. Lbm. minor (Л. минор) Minor - меньше (меньший) Палочки, 0,6-0,8 - 1,5-2 мкм, часто изогнутые с односторонним утолщением. Образует DL-изомеры молочной кислоты и аммиак из аргинина   Kandler, Schillinger, Weiss, 1983; выделен из отстоя молочных машин
41. Lbm. reuteri (Л. реутери) Назван именем Reuter -немецкого бактериолога Палочки 0,7-1 - 2-5 мкм, одиночные. Образует DL-изомеры молочной кислоты и аммиак из аргинина. 40-42,3; Lbm. fermentum Kandler, Stetter, Koh, 1982; из фекалий людей и животных, из мясных продуктов
42. Lbm. sanfrancisco (Л. санфранциско) От названия города San-Francisco, где впервые выделен этот вид Палочки с закругленными кон­цами, 0,6-0,8 мкм. В МРС-бульоне растет при добавлении свежего дрожжевого экстракта с рН 5,6. Образует DL-изомеры молочной кислоты, аммиак из аргинина не образует. Факторы роста: пептид, выделенный из дрожжевого экстракта, оказывает ростостимулирующий эффект. 36-38 Weiss, Schilliger, 1984; из сырого теста
43. Lbm. vaccinostercus (Л. вакциностеркус) Vaccinus - от коров; stercus - навоз; vaccinostercus -из коровьего навоза Палочки с закругленными кон­цами, 0,9-1,0 - 1,5-2,5 мкм. Температурный оптимум 37'С. Образует DL-изомеры молочной кислоты и аммиак из аргинина. Факторы роста: тиамин, пантотеновая кислота, ниацин, биотин   Okada, Suzuki, Kozaki, 1983; из коровьего навоза
44. Lbm. viridescens (Л. виридесценс) Viridescens -растущий зеленым, зеленеющий Мелкие палочки, 0,7-0,9 - 2-5 мкм, с закругленными утонченными (коническими) концами. Не продуцирует аммиак из аргинина. Образует DL-изомеры молочной кислоты. Факторы роста: пантотенат кальция, ниацин, тиамин, рибофлавин, биотин. Стимуляторы - фолиевая кислота, пиридоксаль 41-44 Niven, Evans, 1957; из консервированных мясных продуктов, изменивших цвет, и пастеризованного молока

 

♦ Номера видов и подвидов приведены в соответствии с «Определителем бактерий» Берджи.

Гетероферментативные молочнокислые бактерии ферментируют фруктозу, поскольку у них имеется фермент маннитдегидрогеназа, осуществляющий восстановление фруктозы до маннита. Продуктами сбраживания фруктозы также являются лактаты, ацетаты и углекислый газ.

Лактобактерии обладают слабой протеолитической активностью и поэтому не растут в субстратах, где единственным источником азота является белок, т.е. где отсутствуют различные аминокислоты.

В то же время имеются молочнокислые бактерии, которые могут расщеплять белки. Протеолитически активные штаммы подбирают для составления сырных заквасок.

Молочнокислые бактерии не восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют пигментов, некоторые виды продуцируют каталазу, разлагающую пероксид водорода (Н2О2).

В молочной промышленности используют ограниченное число видов молочнокислых палочек.

Среди термобактерий в качестве заквасочных микроорганизмов чаще применяют Lbm. helveticum (швейцарская палочка), Lbm. delbrueckii subsp. bulgaricum (болгарская палочка), Lbm. acidophilum (ацидофильная палочка), Lbm. delbrueckii subsp. lactis (молочная палочка).

Термофильные молочнокислые палочки являются активными кислотообразователями, они сквашивают молоко через 4-5 ч, предельная кислотность достигает 200-350 ˚Т.

Lbm. helveticum является самым активным кислотообразователем, предельная кислотность при его развитии достигает 350 ˚Т. Эта палочка может сбраживать, кроме лактозы, глюкозы, галактозы, фруктозу, маннозу, ксилозу, мальтозу и декстрин, не сбраживает сахарозу, раффинозу, салицин. Некоторые штаммы развиваются в субстратах, содержащих до 5% поваренной соли.

Штаммы Lbm. helveticum можно выделить из сычуга телят или кислого сырого молока. Микроорганизмы используют в составе заквасок для твердых сыров с высокой температурой второго нагревания.

Lbm. delbrueckii subsp.bulgaricum (рисунок 21).доводит предельную кислотность молока до 200-300 °Т. Штаммы

 

 

Рисунок 22 ‑ Lactobacterium helveticum: a - колония с локоновидно-разветвленным краем; б - длинные палочки

 

 

Рисунок – 23 ‑ Lactobacterium acidophilum: a - поверхностная колония; б - длинные палочки, сгустки казеина, ацидофильное молоко

 

болгарской палочки образуют ацетальдегид - ароматическое вещество, придающее вкус, запах, подавляющее нежелательную микрофлору кишечника. Болгарская палочка чувствительна ко многим антибиотикам, устойчива к бактериофагу). Ее штаммы выделяют, как правило, из сырого молока. Применяют в составе заквасок для производства простокваши мечниковской, южной, 'йогурта, ряженки и др.

Lbm. acidophilum является кишечным микробом, который можно выделить из содержимого пищеварительного тракта человека и различных животных. Ацидофильная палочка способна после культивирования в молоке вновь приживаться в кишечнике человека и подавлять там развитие патогенных и нежелательных микроорганизмов (сальмонеллы, шигеллы, стафилококки, эшерихии и др.).Антагонистическое действие Lbm. acidophilum обусловлено продуцируемыми антибиотиками - ацидофилином и лактоцидином.

Ацидофильные бактерии устойчивы к щелочной реакции (рН 8,3), наличию в среде фенола (0,25-0,4 %), желчи (20 %), NaCl (2 %). Предельная кислотность ацидофильной палочки достигает 200-250 Т. Lbm. acidophilum ферментирует сахарозу, мальтозу, салицин, часто раффинозу, декстрин. Имеются слизеобразующие штаммы ацидофильной палочки.

Lbm. delbrueckii subsp. lactis no своим свойствам и поведению в закваске проявляет большое сходство с болгарской палочкой. Она сбраживает глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, декстрин и салицин. Предельная кислотность молока, сквашенного молочной палочкой, достигает 120-180 °Т, используется в сыроделии.

Сахаролитические свойства термобактерий представлены в таблице 9.

Стрептобактерии обладают менее выраженной кислотообразующей способностью. Они ферментируют молоко через 2-3 сут, предельная кислотность составляет 180 °Т.

Для молочной промышленности имеют значение стрептобактерии Lbm. plantarum и Lbm. casei subsp. rhamnosus. Они способны усваивать, кроме лактозы, также соли молочной кислоты (лактаты), растут в гидролизованном молоке, содержащем 6 % NaCl и 20 % желчи, восстанавливают и свертывают лакмусовое молоко и не образуют аммиак

 

 

Рисунок 24 ‑ Lactobacterium plantarum: a - маленькие, гладкие, блестящие колонии; б - шероховатые колонии с разветвленным краем; в - короткие палочки, располагающиеся цепочками

 

из аргинина. Обладают высокой протеолитической активностью (в 2 раза выше, чем у мезофильных молочнокислых стрептококков), содержание свободных аминокислот в молоке повышают с 10 до 60 мг %. Lbm. casei subsp. rhamnosum в отличие от Lbm. plantarum образует СО2 из цитрата натрия.

Lbm. plantarum продуцирует антибиотик лактолин, действующий угнетающе на кишечную микрофлору и маслянокислые бактерии.

Стрептобактерии обладают хорошо выраженными сахаролитическими свойствами (таблица 11). Они довольно активно ферментируют лактозу, фруктозу, галактозу, маннит, маннозу, рибозу, салицин, эскулин и др. Глюкозу сбраживают без образования газа.

Новые штаммы Lbm. plantarum и Lbm. casei subsp. rhamnosum можно выделить из сырого молока, сыра, с поверхности оборудования для производства сыра, коровьего навоза, силоса и др.

Стрептобактерии играют положительную роль при созревании многих сыров, так как они могут размножаться в них после ферментирования лактозы и при содержании поваренной соли в концентрации до 6%. Некоторые штаммы Lbm. plantarum вызывают образование ржавых пятен на поверхности сыров.

Бетабактерии характеризуются слабой энергией кислотообразования и молоко не сквашивают. При добавлении дрожжевого автолизата к молоку размножение бетабактерий ускоряется и предельная кислотность может достигнуть 150-160 ˚Т.

Бетабактерий в молоке образуют незначительное количество летучих кислот, углекислый газ, этиловый спирт, молочную кислоту. Ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа, мальтозу, рибозу, фруктозу и др. (таблица 13). Большинство видов образуют аммиак из аргинина. Исключение составляют четыре вида - Lbm. bifermentans, Lbm. fructosus, Lbm. sanfrancisco, Lbm. viridenscens, которые аммиак не продуцируют. Бетабактерий не свертывают лакмусовое молоко и лишь

 

 

Рис. 25. Lactobacterium brevis: a — круглые колонии со слегка зазубренным краем; 6 - короткие палочки

частично его восстанавливают (порозовение). Имеют очень слабую терморезистентность, могут развиваться в среде, содержащей 4 % NaCl.

Гетерофёрментативные бетабактерии участвуют в созревании твердых сыров с низкой температурой второго нагревания, способствуют образованию рисунка и формированию запаха сыра. Некоторые штаммы могут обусловливать раннее вспучивание сыра вследствие их способности к газообразованию.

Биологические свойства других бетабактерии, а также их дифференцирующие особенности представлены в таблицах 12, 13.

Лактобактерии широко распространены в окружающей среде. Их часто обнаруживают в молочных, хлебных, мясных и рыбных продуктах, в воде, сточных водах, пиве, вине, фруктах и фруктовых соках, соленых овощах, силосе, кислом тесте и сусле. Они находятся в ротовой полости, кишечнике, на слизистых мочеполового тракта людей и животных.

 

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 9584 | Нарушение авторских прав


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 | 101 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 | 110 | 111 | 112 | 113 | 114 | 115 | 116 | 117 | 118 | 119 | 120 | 121 | 122 | 123 | 124 | 125 | 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | 132 | 133 | 134 | 135 | 136 | 137 | 138 | 139 | 140 | 141 | 142 |

При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.028 сек.)