Антитела и антителообразование
11.1.1. Природа антител
Одной из форм реагирования иммунной системы в ответ на внедрение в организм ан-тигена является биосинтез антител — белков, cпецифически реагирующих с антигенами. Антитела, также как и фагоцитоз, — это одна из наиболее филогенетически древних форм иммунной защиты. Антительный ответ обнаруживается уже у некоторых видов рыб.
Антитела относятся к у-глобулиновой фракции белков сыворотки крови. На долю ga-глобулинов приходится 15—25 % белкового содержания сыворотки крови, что составляет примерно 10—20 г/л. Поэтому антитела получили название иммуноглобулинов, и их обозначают символом Ig. Следовательно, антитела — это ga- глобулины, вырабатываемые в ответ на введение антигена, способные специфически связываться с антигеном и участвовать во многих иммунологических реакциях. Антитела синтезируются В-лим-фоцитами и их потомками — плазматичес-
кими клетками.
Иммуноглобулины существуют в циркулирующей форме, в виде рецепторных молекул на иммунокомпетентных клетках и миелом-ных белков. Циркулирующие антитела подразделяются на сывороточные и секреторные. К антителам могут быть также отнесены белки Бенс-Джонса, которые являются фрагментами молекулы lg (его легкая цепь) и синтезируются в избытке при миеломной болезни.
Строение и функцию антител изучали многие видные ученые. П. Эрлих (1885) предложил первую теорию гуморального иммунитета. Э.Беринг и С. Китазато (1887) получили первые антитоксические сыворотки к дифтерийному и столбнячному токсинам. А. Безредка (1923) разработал метод безопасного введения пациентам лечебных иммунных сывороток. Уже в наши дни большая заслуга в расшифровке строения молекулы Ig принадлежит Д. Эдельману и Р. Портеру (1959), а разгадка многообразия антител — трудам Ф. Бернета (1953) иС. Тонегавы (1983).
Вследствие высокой специфичности и значимости в формировании гуморального иммунитета, антитела используют для диагностики, профилактики и лечения соматических и инфекционных заболеваний, выделения и очист-
ки биологически активных веществ. Для этого на основе специфических иммуноглобулинов созданы соответствующие иммунобиологические препараты (лечебные и диагностические сыворотки, диагностикумы и пр.).
11.1.2. Молекулярное строение антител
Иммуноглобулины являются гликопроте-идами. Их молекула состоит из нескольких соединенных вместе полипептидных цепей, стабилизированных сахаридными остатками. При нагревании выше 60 °С молекула Ig денатурируется. Иммуноглобулины различаются по структуре, атигенному составу, а также по выполняемым функциям.
Молекулы Ig, несмотря на их видимое разнообразие, имеют универсальное строение (рис. 11.1). Если молекулу Ig обработать 2-мер-каптоэтанолом, то она распадется на 2 пары полипептидных цепей: две тяжелых (550-660 аминокислотных остатков, молекулярный вес 50 кДа) и две легких (220 аминокислотных остатков, молекулярный вес — 20—25 кДа). Обозначают их как Н- (от англ. heavy — тяжелый) и L- (от англ. light — легкий) цепи.
Тяжелые и легкие цепи связаны между собой попарно дисульфидными связями (-S-S-).
Между тяжелыми цепями также есть ди-сульфидная связь. Это так называемый «шарнирный» участок. Такой тип межпептидного соединения придает структуре молекулы динамичность — он позволяет легко менять конформацию в зависимости от окружающих условий и состояния. Шарнирный участок ответствен за взаимодействие с первым компонентом комплемента (С1) и активацию его по классическому пути.
Легкие и тяжелые полипептидные цепи молекулы Ig имеют определенные варианты структуры или типы. Они определяются первичной аминокислотной последовательностью цепей и степенью их гликозилирования. Легкие цепи бывают 2 типов: к и лямбда. (каппа и лямбда). Тяжелых цепей известно 5 типов: а, у, ню, е и дельта (альфа, гамма, мю, эпсилон и дельта), — которые имеют также и внутреннее подразделение. Среди многообразия цепей а-типа выделяют alfal- и alfa2- подтипы, а nu-це-пей— ню1- и ню2-. Для gama-цепи известны 4 подтипа: yl-, у2-, уЗ- гама4-.
Вторичная структура полипептидных цепей молекулы lg обладает доменным строением. Это означает, что отдельные участки цепи свернуты в глобулы (домены), которые соединены линейными фрагментами. Домены стабилизированы внутренней дисульфидной связью. Таких доменов в составе тяжелой цепи lg бывает 4—5, а в легкой — 2. Каждый домен состоит примерно из 110 аминокислотных остатков.
Домены различаются по постоянству аминокислотного состава. Выделяют С-домены (от англ. constant — постоянный), с неизменной, или постоянной, структурой полипептидной цепи, и V-домены (от англ. variable — изменчивый), с переменной структурой. В составе легкой цепи есть по одному V- и С-доме-ну, а в тяжелой — один V- и 3—4 С-домена. Примечательно, что не весь вариабельный домен изменчив по своему аминокислотному составу, а лишь его незначительная часть — гипервариабельная область, на долю которой приходится около 25 %.
Вариабельные домены легкой и тяжелой цепи совместно образуют участок, который специфически связывается с антигеном. Это антигенсвязывающий центр молекулы lg, или паратоп.
Гипервариабельные области тяжелой и легкой цепи определяют индивидуальные особенности строения антигенсвязывающего центра для каждого клона lg и многообразие их специфичностей.
Обработка ферментами молекулы lg приводит к ее гидролизу на определенные фрагменты. Так, папаин разрывает молекулу выше шарнирного участка и ведет к образованию трех фрагментов (рис. 11.1). Два из них способны специфически связываться с антигеном. Они состоят из цельной легкой цепи и участка тяжелой (V- и С-домен), и в их структуру входят антигенсвязывающие участки. Эти фрагменты получили название Fab (от англ. «фрагмент, связывающийся с антигеном»). Третий фрагмент, способный образовывать кристаллы, получил название Fc (от англ. «фрагмент кристаллизующийся»). Он ответствен за связывание с рецепторами на мем-
бране клеток макроорганизма (Fc-рецепторы) и некоторыми микробными суперантигенами (например, белком А стафилококка). Пепсин расщепляет молекулу lg ниже шарнирного участка и ведет к образованию 2 фрагментов: Fc и двух сочлененных Fab, или F(ab)r
Помимо вышеописанных, в структуре молекул lg обнаруживают дополнительные полипептидные цепи. Так, полимерные молекулы IgM и IgA содержат J-nenmud (от англ. join — соединяю). Он объединяет отдельные мономеры в единое макромолекулярное образование (см. разд. 11.1.3) и обеспечивает превращение полимерного lg в секреторную форму.
Молекулы секреторных lg в отличие от сывороточных обладают особым S-пептидом (от англ. secret — секрет). Это так называемый секреторный компонент. Его молекулярная масса составляет 71 кДа, и он является be-глобулином. Секреторный компонент — продукт деградации рецептора эпителиальной клетки к J-пептиду. Он обеспечивает перенос молекулы Ig через эпителиальную клетку в просвет органа (трансцитоз) и предохраняет ее в секрете слизистых от ферментативного расщепления.
Рецепторный lg, который локализуется на цитоплазматической мембране В-лимфоци-тов и плазматических клеток, имеет дополнительный гидрофобный трансмембранный М-пептид (от англ. membrane — мембрана). Благодаря гидрофобным свойствам он удерживается в липидном бислое цитоплазматической мембраны, прочно, как якорь, фиксирует рецепторный lg на мембране иммуноком-петентной клетки и проводит рецепторный сигнал через цитоплазматическую мембрану внутрь клетки.
J- и М-пептиды присоединяются к молекуле lg в процессе ее биосинтеза. S-пептид является продуктом эпителиальной клетки— он присоединяется к полимерной молекуле lg при ее транслокации через эпителиальную клетку.
11.1.3. Структурно-функциональные особенности иммуноглобулинов различных классов
В зависимости от особенностей молекулярного строения тяжелой цепи (т. е. наличия изоти-пических, или групповых антигенных детерми-
нант) различают 5 классов, или изотипов Ig (рис. 11.2). Молекулы, содержащие тяжелую цепь ос-типа, относят к изотипу А (сокращенно IgA); IgD обладает 8-цепью, IgE— eps-цепью, IgG— у-цепью и IgM — ц-цепью. Соответственно особенностям строения подтипов тяжелых цепей различают и подклассы Ig.
В структуре молекул Ig разных классов прослеживается общая закономерность — все они построены из одних и тех же элементов, которые были описаны в разд. 9.5.1.2. Однако для каждого изотипа характерны свои особенности. В частности, IgD, IgE и IgG имеют мономерное строение, IgM — практически всегда является пентамером, а молекула IgA может быть моно-, ди- и тримером. Наиболее характерные черты, присущие различным изотипам Ig, приведены в табл. 11.1.
Иммуноглобулин класса G. Изотип G составляет основную массу Ig сыворотки крови. На его долю приходится 70—80 % всех сывороточных Ig, при этом 50 % содержится в тканевой жидкости. Среднее содержание IgG в сыворотке крови здорового взрослого человека 12 г/л. Этот уровень достигается к 7—10-летнему возрасту. Период полураспада IgG — 21 день.
IgG — мономер, имеет 2 антигенсвязы-вающих центра (может одновременно связать 2 молекулы антигена, следовательно, его валентность равна 2), молекулярную массу около 160 кДа и константу седиментации 7S. Различают подтипы Gl, G2, G3 и G4. Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами (В) и плазматическими клетками. Хорошо определяется в сыворотке крови на пике первичного и при вторичном иммунном ответе.
Обладает высокой аффинностью. IgGl и IgG3 связывают комплемент, причем G3 активнее, чем Gl. IgG4, подобно IgE, обладает цитофильностью (тропностью, или сродством, к тучным клеткам и базофилам) и участвует в развитии аллергической реакции I типа (см. разд. 11.4). В иммунодиагностических реакциях IgG может проявлять себя как неполное антитело (см. далее).
Легко проходит через плацентарный барьер и обеспечивает гуморальный иммунитет новорожденного в первые 3—4 месяца жизни. Способен также выделяться в секрет слизистых, в том числе в молоко путем диффузии.
IgG обеспечивает нейтрализацию, опсони-зацию и маркирование антигена, осуществляет запуск комплемент-опосредованного цитолиза и антителозависимой клеточно-опосре-дованной цитотоксичности.
Иммуноглобулин класса М. Наиболее крупная молекула из всех Ig. Это пентамер, который имеет 10 антигенсвязывающих центров, т.е. его валентность равна 10. Молекулярная масса его около 900 кДа, константа седиментации 19S. Различают подтипы Ml и М2. Тяжелые цепи молекулы IgM в отличие от других изотипов построены из 5 доменов. Период полураспада IgM — 5 дней.
На его долю приходится около 5—10 % всех сывороточных Ig. Среднее содержание IgM в сыворотке крови здорового взрослого человека составляет около 1 г/л. Этот уровень у человека достигается уже к 2—4-летнему возрасту.
IgM филогенетически — наиболее древний иммуноглобулин. Синтезируется предшественниками и зрелыми В-лимфоцитами (В). Образуется в начале первичного иммунного ответа, также первым начинает синтезироваться в организме новорожденного — определяется уже на 20-й неделе внутриутробного развития.
Обладает высокой авидностью, наиболее эффективный активатор комплемента по классическому пути. Участвует в формировании сывороточного и секреторного гуморального иммунитета. Являясь полимерной молекулой, содержащей J-цепь, может образовывать секреторную форму и выделяться в секрет слизистых, в том числе в молоко (механизм — см.
IgA). Большая часть нормальных антител и изоагглютининов относится к IgM.
Не проходит через плаценту. Обнаружение специфических антител изотипа М в сыворотке крови новорожденного указывает на бывшую внутриутробную инфекцию или дефект плаценты.
IgM обеспечивает нейтрализацию, опсони-зацию и маркирование антигена, осуществляет запуск комплемент-опосредованного цитолиза и антителозависимой клеточно-опосре-дованной цитотоксичности.
Иммуноглобулин класса А. Существует в сывороточной и секреторной формах. Около 60 % всех IgA содержится в секретах слизистых.
Сывороточный IgA: На его долю приходится около 10—15 % всех сывороточных Ig. В сыворотке крови здорового взрослого человека содержится около 2,5 г/л IgA, максимум достигается к 10-летнему возрасту. Период полураспада IgA — 6 дней.
IgA — мономер, имеет 2 антигенсвязыва-ющих центра (т. е. 2-валентный), молекулярную массу около 170 кДа и константу седиментации 7S. Различают подтипы А1 и А2. Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами (В_alfa) и плазматическими клетками. Хорошо определяется в сыворотке крови на пике первичного и при вторичном иммунном ответе.
Обладает высокой аффинностью. Может быть неполным антителом. Не связывает комплемент. Не проходит через плацентарный барьер.
IgA обеспечивает нейтрализацию, опсони-зацию и маркирование антигена, осуществляет запуск антителозависимой клеточно-опос-редованной цитотоксичности.
Секреторный IgA: В отличие от сывороточного, секреторный IgA (slgA) существует в полимерной форме в виде ди- или тримера (4- или 6-валентный) и содержит J- и S-пеп-тиды. Молекулярная масса 350 кДа и выше, константа седиментации 13S и выше.
Синтезируется В_al-лимфоцитами и их потомками — плазматическими клетками соответствующей специализации только в пределах слизистых и выделяется в их секреты. Объем продукции может достигать 5 г в сутки. Пул slgA считается самым многочисленным в организме — его количество превышает сум-
марное содержание IgM и IgG. В сыворотке крови slgA не обнаруживается.
Формирование молекулы slgA происходит при прохождении через эпителиальную клетку, где он присоединяется к секреторному компоненту. На базальной и латеральной поверхности эпителиальная клетка несет рецептор к J-цепи полимерной молекулы Ig (JR). Образующийся после взаимодействия этого рецептора с полимерной молекулой IgA комплекс эндоцитиру-ется клеткой в виде везикулы. Затем везикула переносится к апикальной поверхности эпите-лиоцита, где JR подвергается ферментативному расщеплению. В итоге IgA высвобождается в слизистый секрет просвета органа уже в секреторной форме — оставшийся прикрепленным к молекуле Ig фрагмент JR является S-цепью.
Секреторная форма IgA — основной фактор специфического гуморального местного иммунитета слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы и респираторного тракта. Благодаря S-цепи он устойчив к действию протеаз. sIgA не активирует комплемент, но эффективно связывается с антигенами и нейтрализует их. Он препятствует адгезии микробов на эпителиальных клетках и генерализации инфекции в пределах слизистых.
Иммуноглобулин класса Е. Называют также реагином. Содержание в сыворотке крови крайне невысоко — примерно 0,00025 г/л. Обнаружение требует применения специальных высокочувствительных методов диагностики. Молекулярная масса — около 190 кДа, константа седиментации — примерно 8S, мономер. На его долю приходится около 0,002 % всех циркулирующих Ig. Этот уровень достигается к 10—15 годам жизни.
Синтезируется зрелыми В-лимфоцитами (ВЕ) и плазматическими клетками преимущественно в лимфоидной ткани бронхолегоч-ного дерева и ЖКТ.
Не связывает комплемент. Не проходит через плацентарный барьер. Обладает выраженной цитофильностью — тропностью к тучным клеткам и базофилам. Участвует в развитии гиперчувствительности немедленного типа — реакция 1 типа (см. разд. 11.4).
Иммуноглобулин класса D. Сведений об Ig данного изотипа не так много. Практически
полностью содержится в сыворотке крови в концентрации около 0,03 г/л (около 0,2 % от общего числа циркулирующих Ig). IgD имеет молекулярную массу 160 кДа и константу седиментации 7S, мономер.
Не связывает комплемент. Не проходит через плацентарный барьер. Является рецептором предшественников В-лимфоцитов.
Рецепторные иммуноглобулины. Рецепторные, или мембраные Ig, локализуются на цитоп-лазматической мембране В-лимфоцитов. Выполняют функции антигенспецифических рецепторов. Рецепторные Ig имеют те же изо-тип и специфичность, что и синтезируемые в межклеточную среду антитела. Структурное отличие от секретируемых антител заключается в особом, дополнительном М-пептиде, благодаря которому молекула рецепторного Ig фиксируется в цитоплазматической мембране иммунокомпетентной клетки.
Нормальные антитела. В сыворотке крови человека всегда определяется базальный уровень иммуноглобулинов, которые получили название нормальных, или естественных, антител. К нормальным антителам относят изогемагглютинины — антитела различной аффинности и специфичности направленные против эритроцитарных антигенов групп крови (система АВО), а также против бактерий кишечной группы, кокков и некоторых вирусов. Эти антитела постоянно образуются в организме без явной антигенной стимуляции. С одной стороны, они отражают готовность макроорганизма к иммунному реагированию, а с другой — могут свидетельствовать об отдаленном контакте с антигеном.
Моноклональные антитела. Каждый В-лим-фоцит и его потомки, образовавшиеся в результате пролиферации (т. е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природных условиях макроорганизма получить моноклональные антитела практически невозможно. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначительно различающихся антигенной специфичностью рецепторов и, естественно, аффинностью. Поэтому в результате иммунизации даже
монодетерминантным антигеном мы всегда получаем поликлоналъные антитела.
Принципиально получение моноклональных антител выполнимо, если провести предварительную селекцию антителопродуцирую-щих клеток и их клонирование (т. е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений.
Проблема получения моноклональных антител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Мильштейном (1975). Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммунных В-лимфоцитов с миеломной (опухолевой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопро-дуцента и «бессмертием» раковотрансфор-мированной клетки. Такой вид клеток получил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неограниченном количестве вырабатывает антитела. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных клеток, обладавшие наивысшей продуктивностью и наибольшей аффинностью специфических антител.
Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных иммунобиологических препаратов.
Полные и неполные антитела. Среди многообразия Ig выделяют полные и неполные антитела. Деление основано на способности образовывать в реакции агглютинации или преципитации (in vitro) хорошо различимую глазом макромолекулярную структуру гигантского иммунного комплекса. Таким свойством обладают полные антитела. К ним относятся полимерные молекулы Ig (изотип М), а также некоторые IgA и IgG.
Неполные антитела лишены такой способности, несмотря на то что они специфически связываются с антигеном. В связи с этим их еще называют непреципитирующими или блокирующими антителами. Причиной этого явления может быть экранирование одного из антигенсвязывающих центров мономерной
молекулы Ig, а также недостаточное число или малая доступность антигенных детерминант на молекуле антигена. Выявить неполные антитела можно при помощи реакции Кумбса — путем использования «вторых», ан-тииммуноглобулиновых антител (см. гл. 13).
Другие виды антител. Помимо вышеприведенных различают тепловые и холодовые антитела. Первые взаимодействуют с антигеном при температуре +37 °С. Для вторых наибольшая эффективность связывания проявляется в диапазоне +4... —10°С. Понижение температуры реакционной смеси позволяет в ряде случаев (например, при отсутствии специфического антигена) ограничить низкоаффинные взаимодействия и повысить специфичность реакции.
По способности активировать комплемент (классический путь) антитела подразделяются на комплементсвязывающие (IgM, IgGl и IgG3) и комплементнесвязывающие.
В последние годы открыт вид антител, которые выполняют функции катализаторов биохимических процессов — обладают про-теазной или нуклеазной активностью. Это реликтовые свойства антител. Такие антитела получили название абзимы.
Большим достижением молекулярной биологии в области иммунологии, помимо гибридом, явилось получение белков со свойствами антител — это одноцепочечные антитела, бифункциональные антитела и иммунотокси-ны. Они синтезируются живыми биологическими системами. Одноцепочечные антитела представляют собой фрагмент вариабельного домена Ig, который обладает определенной специфичностью и аффинностью и способен к блокирующему действию. Размер такой молекулы очень мал и практически не обладает иммуногенностью. Бифункциональные антитела имеют антигенсвязывающие центры разной специфичности, т. е. направлены к различным антигенным детерминантам. Иммунотоксины представляют собой гибрид молекулы иммуноглобулина и токсина. Они способны направленно доставить молекулу токсина к клетке-мишени, убить ее или нарушить в ней метаболические процессы.
Иммунотоксины и бифункциональные антитела имеют большое будущее. В перспекти-
ве их будут использовать для иммунодиагностики, а также профилактики и лечения инфекционных, онкологических,аллергических и других заболеваний.
11.1.4. Антигенность антител Иммуноглобулин, как и всякий белок, об ладает антигеностью и выраженной иммуно генностью. В молекуле Ig различают 4 типа атигенных детерминант: видовые, изотопи ческие, аллотипические и идиотипические. Видовые антигенные детерминанты характер ны для Ig всех особей данного вида (напри мер, кролика, собаки, человека). Они опреде ляются строением легкой и тяжелой цепи. По этим детерминантам можно идентифициро вать видовую принадлежность антител.
Изотипические антигенные детерминанты являются групповыми. Они локализуются в тяжелой цепи и служат для дифференцировки семейства Ig на 5 изотипов (классов) и множество подклассов (см. разд. 11.1.3).
Аллотипические антигенные детерминанты являются индивидуальными, т. е. присущими конкретному организму. Они располагаются в легкой и тяжелой полипептидных цепях. На основании строения аллотипических детерминант можно различать особи внутри одного вида.
Идиотипические антигеннные детерминанты отражают особенности строения ан-тигенсвязывающего центра самой молекулы Ig. Они образованы V-доменами легкой и тяжелой цепи молекулы Ig. Обнаружение идиотипических антигенных детерминант послужило основанием для создания теории «идиотип-антиидиотипической» регуляции биосинтеза антител.
11.1.5. Механизм взаимодействия антитела с антигеном
В процессе взаимодействия с антигеном принимает участие не вся молекула Ig, а лишь ее ограниченный участок — антигенсвязыва-ющий центр, или паратоп, который локализован в Fab-фрагменте молекулы Ig. Co своей стороны, антитело взаимодействует не со всей молекулой антигена сразу, а лишь с ее антигенной детерминантой.
Антитела отличает специфичность взаимодействия, т. е. способность связываться со
строго определенной антигенной детерминантом. Наиболее доступные для взаимодействия эпитопы располагаются на поверхности молекулы антигена.
Связь антигена с антителом осуществляется за счет слабых взаимодействий (ван-дер-ваальсовы силы, водородные связи, электростатические взаимодействия) в пределах антигенсвязывающего центра. Такая связь отличается неустойчивостью — образовавшийся иммунный комплекс (ИК) может легко диссоциировать на составляющие его компоненты. Поэтому взаимодействие антигена и антитела может быть представлено в виде уравнения:
[АГ] + [AT] <-> [ИК].
Продолжительность существования иммунного комплекса определяется целым рядом факторов. При этом важное значение имеют особенности антитела, антигена и условия, в которых происходит их взаимодействие.
К особенностям антитела следует отнести его аффинность и авидность.
Аффинность — сила специфического взаимодействия антитела с антигеном (или энергия их связи). Эта характеристика зависит от степени стерического, или пространственного, соответствия (комплементарности) структуры антигенсвязывающего центра и антигенной детерминанты. Чем выше их компле-ментарность, т. е. чем больше они подходят друг другу, тем больше образуется межмолекулярных связей и тем выше будет устойчивость и продолжительность жизни образовавшегося иммунного комплекса. Структурные несоответствия антигенсвязывающего центра и антигенной детерминанты существенно снижают число образующихся связей и прочность взаимодействия антитела с антигеном. Иммунный комплекс, образованный низкоаффинными антителами, чрезвычайно неустойчив, имеет малую продолжительность существования и быстро распадается на исходные компоненты.
Установлено, что в условиях макроорганизма с одной и той же антигенной детерминан-той способны одновременно прореагировать и образовать иммунный комплекс около 100 различных клонов антител. Все они будут отличаться структурой антигенсвязывающего центра и аффинностью. Аффинность антител
существенно меняется в процессе иммунного ответа в связи с селекцией наиболее специфичных клонов В-лимфоцитов. Наименее аффинными считаются нормальные антитела. По расчетам, общее число различных ан-тигенспецифических клонов В-лимфоцитов достигает 106—107.
Под термином «авидность» понимают прочность связывания антитела и антигена. Эта характеристика определяется аффинностью Ig и числом антигенсвязывающих центров. При равной степени аффинности наибольшей авид-ностью обладают антитела класса М, так как они имеют 10 антигенсвязывающих центров.
Особенности антигена также влияют на эффективность его взаимодействия с антителом. Так, важное значение имеют стерическая (пространственная) доступность антигенной детерминанты для антигенсвязывающего центра молекулы Ig и число эпитопов в составе молекулы антигена.
Эффективность взаимодействия антитела с антигеном существенно зависит от условий, в которых происходит реакция, и прежде всего от рН среды, осмотической плотности, солевого состава и температуры среды. Оптимальными для реакции антиген—антитело являются физиологические условия внутренней среды макроорганизма: близкая к нейтральной реакция среды, присутствие фосфат-, карбонат-, хлорид- и ацетат-ионов, осмолярность физиологического раствора (концентрация раствора 0,15 М), а также температура (36—37 °С).
11.1.6. Свойства антител
Благодаря уникальной способности специфически связываться с антигенными детерминантами, антитела выполняют в организме ряд важнейших функций, как форма иммунного реагирования и фактор регуляции иммунореактивности. При этом необходимо дифференцировать эффекты специфического, высокоаффинного взаимодействия и неспецифического, низкоаффинного.
В результате специфического взаимодействия эпитопа молекулы антигена с парато-пом молекулы антитела может образоваться устойчивый иммунный комплекс с продолжительностью жизни, достаточной для про-
явления эффекторных свойств молекулы иммуноглобулина. Это означает, что благодаря своим уникальным способностям антитела могут оказывать прямое или опосредованное воздействие на молекулы антигена: нейтрализовать или маркировать антиген, вызвать его деструкцию или элиминацию.
К прямым эффектам антител относится нейтрализация. Она достигается путем связывания и блокирования паратопом иммуноглобулина активного центра биологически активной молекулы, например, токсина, рецептора, лекарственного препарата и пр. Эффект имеет обратимый характер в случае распада иммунного комплекса и требует подключения других механизмов иммунной защиты (фагоцитоз, лизис). На принципе нейтрализации основан механизм действия антитоксических, противовирусных и многих других лечебных иммунных сывороток.
Энзиматическое действие антител также относится к прямым эффектам. Они связаны со стабильной областью V-домена L-цепи. Благодаря реликтовой протеазной или нук-леазной активности (см. разд. 11.1.3), иммуноглобулины способны вызывать деструкцию молекулы антигена (например, расщепление отдельных пептидов или ДНК).
В большинстве случаев взаимодействие антител с антигеном в организме не влечет за собой непосредственно нейтрализацию биологического действия последнего, а также его разрушение или утилизацию. Прочно связываясь с эпиопом, антитела «маркируют» молекулу антигена — обозначают его как мишень для факторов элиминации или деструкции (фагоцитоз, лизис).
К непрямым эффектам относятся:
• активация комплемента по классическому пути и индукция комплемент-опосредованного лизиса чужеродных клеток (см. разд. 9.2.3.3); наилучшими свойствами обладает IgM (IgM> IgG3> IgG1);
• запуск антителозависимой клеточно-опос-редованной цитотоксичности (см. разд. 11.3);
• опосредование гиперчувствительности немедленного типа, или I типа (см. разд. 11.4);
• индукция иммунного фагоцитоза, приводящая к элиминации любых форм антигена из организма (см. разд. 11.2).
Клеточно-опосредованные эффекты иммуноглобулинов реализуются благодаря экспрессии на мембране иммунокомпетентных клеток рецепторов к Fc-фрагменту молекулы иммуноглобулина (FcR). Эти рецепторы являются трансмембранными белковыми молекулами и различаются по специфичности и аффинности. FcR всегда специализирован к определенному изотипу тяжелой цепи молекулы Ig. Различают высокоаффинные и низкоаффинные FcR. Первые могут взаимодействовать с интакт-ной молекулой иммуноглобулина, используя ее в дальнейшем как ко-рецепторный фактор (базофилы, тучные клетки); вторые — связываются с молекулой lg в составе иммунного комплекса. Поэтому FcR называют непрямыми иммунорецепторами.
Помимо обладания эффекторными свойства, антитела являются активными регуляторами иммунореактивности. Так, Ig служат антигенспецифическими рецепторами В-лимфоцитов. Благодаря выраженной цито-фильности, они также выполняют функцию специфических ко-рецепторных факторов ба-зофилов и тучных клеток2 (см. выше).
Согласно теории «идиотип-антиидиотипи-ческого взаимодействия», антитела, специфичные к идиотипическим антигенным детерминантам lg, могут управлять силой антительного иммунного реагирования.
Активное специфическое связывание высо-коиммуногенных эпитопов специфическими антителами может блокировать развитие как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Этот эффект используется в клинической практике, например, для профилактики гемолитической болезни новорожденных в результате резус-конфликта.
Вместе с тем антитела могут неспецифически взаимодействовать с молекулой антигена за счет неспецифической адсорбции или низкоаффинного связывания. Это позволяет антителам наряду с другими веществами участвовать в опсонизации антигена и таким образом неспецифически ингибировать его биологическое действие.
К неспецифическим свойствам антител относится также их способность захватывать ионы некоторых металлов — микроэлементов или тяжелых металлов, таких как ртуть и
свинец. Кроме того, антитела могут взаимодействовать с рядом суперантигенов. Однако их связывание происходит нетипично — без участия паратопа. В настоящий момент достоверно известно существование трех таких суперантигенов: протеина А стафилококка (SpA), gp 120 ВИЧ-1 и кишечного сиалопро-теина. Перечисленные суперантигены могут нейтрализовать биологическую активность антител и потенцировать иммунодефицитные состояния.
11.1.7. Генетика иммуноглобулинов
Молекулам Ig присуще не только уникальное строение, но также и своеобразное генетическое кодирование. Методами молекулярной генетики было доказано, что, в отличие от других белков, структура молекулы Ig изначально контролируется не одним, а большим числом генов. Гены иммуноглобулинов имеют фрагментарную организацию и образуют три группы, которые располагаются в трех различных хромосомах и наследуются независимо.
Первая группа генов содержит информацию о первичной аминокислотной последовательности легкой цепи к-типа, вторая — легкой цепи la.-типа, а третья — всех типов тяжелых цепей (al, ga, de, XZ), nu). Гены, относящиеся к
каждой группе, находятся на соответствующей хромосоме в непосредственной близости друг от друга. Они располагаются последовательно (рис. 11.3) и разделены интронами (некодирующие области).
Участок ДНК, кодирующий строение легкой цепи А.-типа, содержит 2 V-сегмента (контролируют структуру V-доменов) и 4 С-сегмента (контролируют структуру С-доменов). Между С- и V-сегментами располагается J-сегмент (от англ .join — соединяющий). Легкая цепь к-типа кодируется несколькими сотнями V-сегментов ДНК, 4 J-сегментами и одним С-сегментом. Группа генов, контролирующая структуру тяжелых цепей, имеет еще более сложное строение. Наряду с V-, С- и J- сегментами ДНК в их состав входят 20 D-сегментов (от англ. diversity— разнообразие). Кроме того, имеется М-сегмент, который кодирует биосинтез мем-бранно-ассоциированного участка молекулы рецепторного Ig.
При созревании пре-В-лимфоцитов наблюдаются мощные перестройки в их генетическом аппарате. Происходит произвольное сближение отдельных фрагментов ДНК и сборка в пределах соответствующих хромосом единых функциональных генов. Пропущенные участки ДНК исключаются из дальнейшего считывания. Этот процесс называется сплайсинг
(англ. splicing — сращивание, состыковывание). С функциональных генов в дальнейшем транскрибируется про-мРНК, а затем — окончательная мРНК, кодирующая первичную аминокислотную последовательность L- и Н-цепей молекулы Ig. Параллельно со сплайсингом в отдельных участках V-сегментов генов иммуноглобулинов наблюдается мутационный процесс и нематричная достройка олигонук-леотидов. Эти участки ДНК получили название гипермутабельные области.
Сплайсинг и мутационный процесс в генах Ig носят случайный, стохастический характер и происходят в каждом лимфоците независимо друг от друга. Явления, происходящие в генах Ig при их созревании, в бесконечное количество раз повышают разнообразие V-доменов молекулы Ig. Они являются причиной неповторимой уникальности структуры паратопов и идиотипических антигенных детерминант молекулы Ig, а также множественности антигенной специфичности рецепторов В-лимфо-цитов и синтезируемых ими антител.
Таким образом, учитывая непрерывность лимфогенеза, в пределах организма уже предсу-ществуют или в любой момент могут возникнуть В-лимфоциты, специфичные к практически любому антигену. Молекулярно-генетическая теория происхождения многообразия специ-фичностей антител была подробно разработана С. Тонегавой (1983).
Дальнейшая дифференцировка В-лимфоци-тов, которая возникает при их продуктивной активации в процессе первичного иммунного ответа, идет параллельно с их размножением. Она также сопровождается рекомбинационными перестройками в пределах иммуноглобулино-вых генов, но уже в пределах С-сегментов. Этот процесс проявляется последовательной сменой класса Ig: если на ранних этапах дифференци-ровки В-лимфоциты синтезируют Ig классов М и D, то на более поздних — классов G, А или Е (редко). Параллельно наблюдается «дрейф» (точечные перестройки) в V-сегментах. Это ведет к появлению вариаций в специфичности BCR и субклонированию В-лимфоцитов.
11.1.8. Динамика антителопродукции
Способность синтезировать антитела макроорганизм приобретает довольно рано. Уже
на 13-й неделе эмбрионального периода развития возникают В-лимфоциты, синтезирующие IgM, а на 20-й неделе этот Ig можно определить в сыворотке крови. С этого момента в организме начинается процесс непрерывного появления новых антителопродуцирующих клеток с различной специфичностью, которые исходно формируют базальный уровень антител, преимущественно изотипа М — это нормальные антитела. Содержание Ig в сыворотке крови существенно меняется с возрастом, а также зависит от состояния макроорганизма. Концентрация антител достигает максимума к периоду полового созревания и сохраняется на высоких цифрах в течение всего репродуктивного периода (период половой зрелости до старости). В старческом возрасте содержание антител снижается. Повышение количества Ig наблюдается при инфекционных заболеваниях, аутоиммунных расстройствах; снижение его отмечено при некоторых опухолях и им-мунодефицитных состояниях.
При появлении во внутренней среде макроорганизма антигена иммунная система реагирует усилением биосинтеза специфических антител, что достигается путем размножения клонов антигенспецифичных клеток-анти гелопродуцентов. При этом антиген выступает в роли не только триггер-ного, но и селектирующего фактора.
Преимущество получают клоны с наивысшей специфичностью, т. е. наибольшей аффинностью рецепторных молекул Ig. Параллельно с размножением идет процесс дифференцировки В-лимфоцитов. Наблюдается перестройка в геноме клеток и переключение их биосинтеза с крупной вы-сокоавидной молекулы IgM на более легкие и экономичные высокоаффинные IgG или IgA (редко IgE).
Антителопродукция в ответ на антигенный стимул имеет характерную динамику. Ее можно проследить на примере сывороточных Ig (рис. 11.4). Выделяют латентную (индуктивную), логарифмическую, стационарную фазы и фазу снижения. В латентную фазу антителопродукция практически не изменяется и остается на базальном уровне. В этот пери-
од происходит переработка и представление антигена иммунокомпетентным клеткам и запуск пролиферации антигенспецифичных клонов клеток-антителопродуцентов. Ввиду того, что клетки делятся дихотомически (т. е. надвое), прирост их численности происходит в логарифмической зависимости. Поэтому после первых циклов деления прирост числа клеток в общей массе невелик, и титры специфических антител практически не изменяются. Параллельно происходит созревание пре-В-лимфоцитов в зрелые формы, включаются процессы дифференцировки антите-лопродуцентов в плазматические клетки и переключение синтезируемых изотипов Ig.
Во время логарифмической фазы наблюдается интенсивный прирост количества антиген-специфичных В-лимфоцитов, что находит отражение в существенном нарастании титров специфических антител.
В стационарной фазе количество специфических антител и синтезирующих их клеток достигает максимума и стабилизируется. Освобождение макроорганизма от антигена устраняет антигенный стимул, поэтому вслед за стационарной фазой начинается фаза сни-
жения. В этот период наблюдается постепенное уменьшение численности клонов специфических антителопродуцентов и титров соответствующих антител.
Динамика антителообразования имеет характерную временную зависимость. Она также существенно зависит от первичности или вторичности контакта с антигеном. При первичном контакте с антигеном развивается первичный иммунный ответ. Для него характерны длительная латентная (3—5 суток) и логарифмическая (7—15 суток) фазы. Первые диагностически значимые титры специфических антител регистрируются на 10—14-е сутки от момента иммунизации. Стационарная фаза продолжается 15—30 суток, а фаза снижения— 1—6 месяцев.
В течение первичного иммунного ответа под влиянием цитокинов Т2-хелпера происходит созревание и размножение клонов антигенспецифичных В-лимфоцитов. Их дифференци-ровка приводит к образованию плазматических клеток. Происходит также переключение биосинтеза Ig с изотипов М и D на G, А или Е. В итоге первичного иммунного реагирования формируются многочисленные клоны
антигенспецифичных В-лимфоцитов: антител опродуцирующих клеток и В-лимфоцитов иммунологической памяти, а во внутренней среде макроорганизма в высоком титре накапливаются специфические IgG и/или IgA (а также IgE). Таким образом обеспечивается активное противодействие иммунной системы внедрению в макроорганизм антигена и высокая готовность к повторной встрече с ним.
Со временем антительный ответ угасает. Накопление в избытке свободных IgG/IgA потенцирует гибель активных антителопродуцен-тов. Элиминация антигена исключает новое стимулирование и клонообразования, а появившиеся ранее плазматические клетки имеют короткую продолжительность жизни. Вместе с тем В-лимфоциты иммунологической памяти надолго остаются циркулировать в организме.
Повторный контакт иммунной системы с тем же антигеном ведет к формированию вторичного иммунного ответа (рис. 11.4). В отличие от первичного, для вторичного ответа характерна укороченная латентная фаза — от нескольких часов до 1—2 суток. Логарифмическая фаза отличается более интенсивной динамикой прироста и более высокими титрами специфических антител. Для стационарной фазы и фазы снижения свойственна затяжная динамика (несколько месяцев или даже лет). При вторичном иммунном ответе организм сразу же, в подавляющем большинстве синтезирует IgG. Характерная динамика антителопродук-ции обусловлена подготовленностью иммунной системы к повторной встрече с антигеном за счет формирования иммунологической памяти (см. разд. 11.5). В результате этого клоны антигенспецифичных В-лимфоцитов, оставшиеся после первичного иммунного реагирования, быстро размножаются и интенсивно включаются в процесс антителогенеза.
Для развития гуморального иммунитета слизистых характерны те же процессы и динамика антителообразования. Однако в данном случае в слизистых в подавляющем большинстве созревают и размножаются В-лимфоциты, продуцирующие полимерные молекулы IgA.
Явление интенсивного антителообразова-ния при повторном контакте с антигеном широко используется в практических целях, например при вакцинопрофилактике. Для со-
здания и поддержания иммунитета на высоком защитном уровне схемы вакцинации предусматривают первичное введение антигена для формирования иммунологической памяти и последующие ревакцинации через различные интервалы времени (см. гл. 14).
Этот же феномен используют при получении высокоактивных лечебных и диагностических иммунных сывороток (гипериммунных). Для этого животным или донорам производят многократные введения препаратов антигена по специальной схеме.
Динамика и интенсивность антителообра-зования в значительной степени зависят от иммуногенности антигена (дозы, способа и кратности его введения), а также от состояния макроорганизма. Попытка повторного введения антигена в латентной фазе может привести к иммунологическому параличу — иммунологической неотвечаемости на антиген в течение определенного периода времени.
11.1.9. Теории разнообразия антител
Для объяснения механизмов антителопро-дукции и разнообразия специфичности антител было высказано множество гипотез и теорий, однако лишь немногие из них получили практическое подтверждение. Большинство теорий имеют чисто историческое значение.
Первой принципиально важной концепцией была теория «боковых цепей», которую выдвинул П. Эрлих (1898). Согласно этой теории, клетки органов и тканей имеют на своей поверхности рецепторы, способные в силу химического сродства связывать антиген и инактивировать его; связанные с антигеном рецепторные молекулы отделяются с поверхности клетки и замещаются вновь синтезированными. Эта теория заложила основные представления о гуморальном иммунитете и о рецепторах иммунокомпетентных клеток.
Заслуживаютвнимания «инструктивные»или «матричные» теории. Согласно концепциям, предложенным Ф. Брейнлем и Ф. Гауровитцем (1930), Л. Полингом (1940), антиген является матрицей, с которой штампуется молекула антител. Эти теории оказались тупиковыми в связи с открытием Д. Уотсоном и Ф. Криком (1953) механизма кодирования в ДНК генетической информации.
Ряд теорий исходил из предположения о предсуществовании в организме антител практически ко всем возможным антигенам (Н. Ерне, 1955; Ф. Бернет, 1959). В настоящее время наиболее обоснованной считается теория Ф. Бернета, которая получила название клоналъно-селекционной. Согласно данной теории, лимфоидная ткань состоит из огромного числа клонов антигенореактивных клеток (лимфоцитов), которые специализируются на выработке антител к разнообразным антигенам. Клоны возникли в ходе эволюции в результате мутаций и селекции под влиянием антигенов и уже предсуществуют в новорожденном организме. Попавший в организм антиген селективно (избирательно) активирует специфичный к нему клон лимфоцитов, который размножается и начинает вырабатывать специфичные к данному антигену антитела. Если доза антигена велика, то клон реагирующих на него лимфоцитов устраняется (элиминируется) из организма. В соответствии с теорией Бернета, этот путь ведет к формированию в эмбриональном периоде иммунологической толерантности (нечувствительности) к собственным антигенам.
Теория Бернета объясняет многие иммунологические реакции (антителообразование, гетерогенность антител, иммунологическую память, толерантность), однако она не способна объяснить происхождение всего многообразия специфичности антител. Бернет предположил, что в организме существует около 10 тыс. клонов специфических антителопродуцирующих клеток. Однако, как показывает практика, мир антигенов на 2—3 порядка обширнее, и организм отвечает на практически любой из них, в том числе и на искусственно полученный антиген, который не существует в природе.
Значительную ясность в представление о разнообразии специфичности антител внес С. Тонегава (1983), который дал этому явлению генетическое обоснование. Молекулярно-генетическая теория С. Тонегавы исходит из того, что в генах иммуноглобулинов постоянно происходят мощные рекомбинационные и мутационные процессы. В результате возникает огромное количество вариантов и комбинаций генов, которые кодируют разнообразные по специфичности иммуноглобулины. Каждый клон антителопродуцирующих
лимфоцитов обладает своим уникальным вариантом гена иммуноглобулина (см. разд. 11.1.7).
Следует также упомянуть теорию сетевой регуляции иммунной системы. Ее основой является выдвинутая Н. Ерне (1974) идея идиотип-ан-тиидиотипического взаимодействия. Согласно этой теории, иммунная система представляет собой бесконечную цепь взаимодействующих антигенных идиотипов иммуноглобулинов и направленных к ним антиидиотипических антител. Введение антигена вызывает каскадную реакцию образования антител 1-го порядка. Это антитело, действуя как антиген, вызывает образование к своему идиотипу антител 2-го порядка. К идиотипу антител 2-гО порядка синтезируются антитела 3-го порядка и т. д. При этом антитело каждого порядка как бы несет «внутренний образ» антигена, который передается эстафетно в цепи образования антиидиотипических антител. Доказательством этой теории является обнаружение антиидиотипических антител, способных вызвать в организме иммунитет к соответствующему антигену, а также существование лимфоцитов, сенсибилизированных к антиидиоти-пическим антителам. С помощью теории Ерне можно понять формирование иммунологичской памяти и возникновение аутоиммунных реакций. Однако она не способна объяснить многие другие явления иммунитета: механизм иммунологического распознавания «свой-чужой», управление каскадом идиотип-антиидиотипичес-ких реакций и т. д. Данная теория не получила дальнейшего развития.
В 60-е годы XX в. выдающийся отечественный иммунолог П. Ф. Здродовский сформулировал физиологическую концепцию иммуногенеза — гипоталамо-адреналовую теорию регуляции иммунитета. Основная идея этой теории сводилась к тому, что продукция антител подчиняется общим физиологическим законам. Ведущая роль в этом процессе принадлежит гормонам и нервной системе.
Дата добавления: 2015-08-26 | Просмотры: 2038 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 | 101 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 | 110 | 111 | 112 | 113 | 114 | 115 | 116 | 117 | 118 | 119 | 120 | 121 | 122 | 123 | 124 | 125 | 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | 132 | 133 | 134 | 135 | 136 | 137 | 138 | 139 | 140 | 141 | 142 | 143 | 144 | 145 | 146 | 147 | 148 | 149 | 150 |
|