 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Диагностика ВИЧ-инфекцииОсновные методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции включают выявление антител к вирусу, вирусных антигенов и выделение вируса в культуре клеток. Как уже говорилось, антитела к вирусу появляются в сыворотке большинства ВИЧ-инфицированных через 4—8 нед после заражения. Стандартным методом диагностики ВИЧ-инфекции служит определение антител к ВИЧ с помощью ИФА. Этот метод очень надежен, его чувствительность составляет более 99,5%. В большинстве диагностических лабораторий для проведения этого анализа используются коммерческие наборы, позволяющие определять антитела как к ВИЧ-1, так и к ВИЧ-2, поскольку в состав наборов входят естественные или рекомбинантные антигены ВИЧ обоих типов. Набор антигенов в этих наборах постоянно обновляется, что позволяет повысить их чувствительность при определении антител к новым штаммам ВИЧ, например штаммам группы О (рис. 308.5). Результаты анализа обычно расценивают как положительные, отрицательные или сомнительные. Однако специфичность этого метода мала. Так, при обследовании лиц из группы низкого риска ВИЧ-инфекции (например, доноров крови) оказалось, что лишь 13% людей с положительными результатами ИФА были действительно инфицированы ВИЧ. Причинами ложноположительного результата могут быть наличие в сыворотке антител к HLA класса II и другим аутоантигенам, болезни печени или недавняя вакцинация против гриппа. Таким образом, все случаи положительного и сомнительного результатов ИФА должны быть проверены с помощью более специфичных методов. Для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции чаще всего используют иммуноблоттинг (рис. 308.19). Поскольку этот метод позволяет разделить антигены по молекулярной массе, то удается одновременно обнаружить антитела к нескольким антигенам ВИЧ. О наличии антител к определенному антигену судят по появлению окрашенной полосы на участке мембраны, где локализован данный антиген. При отрицательном результате иммуноблоттинга (отсутствии окрашенных полос) положительные и сомнительные результаты ИФА расцениваются как ложноположительные. Если на мембране обнаруживают три полосы, соответствующие продуктам разных генов (gag, pol и env), то результат иммуноблоттинга — заведомо положительный. Однако в большинстве лабораторий результаты иммуноблоттинга оценивают в соответствии с критериями, принятыми Ассоциацией руководителей медицинских лабораторий США и Центром по контролю заболеваемости: результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ — р24, gp41 и gp 120 (или gp 160). Положительный результат им-
ааа YYY ААА ААА ААА ААА ААА ААА ААА ААА YYY YYY АА'Х ААА АА'Х ААА АА'Х ААА АА'Х ААА АХ'Х ААА -рбб- pal . р31. дад -р55- I p24- H -р18- -160 --120 - • Рисунок 308.19. Иммуноблоттинг. А. Принцип метода. Б. Результаты иммуноблоттинга. Для выявления антител к ВИЧ использовали антигены ВИЧ-1. В сыворотке здорового человека, иммунизированного белками внешней оболочки ВИЧ, присутствуют антитела только к этим вирусным белкам. В сыворотке ВИЧ-инфицированного, зараженного ВИЧ-2, присутствуют антитела, перекрестно реагирующие с продуктами генов pol и gag ВИЧ-1.
1.Электрофоретическое разделение белков 2. Перенос вирусных белков на мембрану и ее сыворотки 3. Инкубация мембраны в присутствии антител 4. Появление окрашенных попос на мембране
1.Положительный результату ВИЧ- 2. Результат у здорового человека, 3. Сомнительный результат у ВИЧ- 4. Сомнительный результат при наличии в 5. Отрицательный результат
1 Если результат повторного иммуноблоттинга остается сомнительным, диагноз ВИЧ-инфекции маловероятен. Для окончательного исключения этого диагноза иммуноблоттинг повторяют еще два раза с интервалом в 3 мес (вместо иммуноблоттинга можно использовать методы определения антигена р24 или вирусной РНК). Рисунок 308.20. Диагностический алгоритм при подозрении на ВИЧ-инфекцию. Результаты: (+) — положительный; (—) — отрицательный; (+/—) — сомнительный. муноблоттинга подтверждает диагноз ВИЧ-инфекции. Если результат иммуноблоттинга нельзя расценить как положительный или отрицательный, его считают сомнительным. Наиболее вероятная причина сомнительного результата — наличие в сыворотке здорового человека антигенов, перекрестно реагирующих с антителами к каким-либо антигенам ВИЧ, чаще всего с антителами к р24 и р55. Сомнительный результат иммуноблоттинга может быть получен и при обследовании ВИЧ-инфицированных, у которых гуморальный иммунный ответ на вирус находится на ранней стадии развития. В связи с этим при получении сомнительных результатов иммуноблоттинга его обязательно повторяют через месяц. Для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции можно использовать также ловушечный ИФА на антиген р24 и методы выявления вирусной РНК (см. ниже). Иммуноблоттинг прекрасно подходит для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции, но не годится как предварительный метод диагностики: у 20—30% лиц с отрицательными результатами ИФА и ПЦР при иммуноблоттинге обнаруживается как минимум одна окрашенная полоса. Обычно эти полосы окрашены слабо. Они образуются в результате перекрестных реакций с антигенами, не связанными с ВИЧ. Тем не менее при получении таких результатов иммуноблоттинга необходимы дальнейшие исследования (ПЦР для выявления вирусной РНК или ДНК, метод разветвленной ДНК или ловушечный ИФА на антиген р24), поскольку они позволяют подтвердить диагноз ВИЧ-инфекции на самых ранних стадиях. Диагностический алгоритм при подозрении на ВИЧ-инфекцию приведен на рис. 308.20. В первую очередь проводят ИФА. Если результат исследования отрицателен и отсутствуют указания на возможность недавнего заражения (в течение 3 мес перед обследованием), диагноз ВИЧ-инфекции исключают. Исследование повторяют при подозрении на недавнее заражение, а также при положительном (или сомнительном) результате первого исследования. В последнем случае отрицательный результат двух последовательных исследований исключает диагноз ВИЧ-инфекции и свидетельствует о технических ошибках, допущенных при первом исследовании. Если результаты повторных ИФА положи-
ВИЧ-инфекция и СПИД тельны или сомнительны, проводят иммуноблоттинг. Положительный результат иммуноблоттинга служит подтверждением диагноза ВИЧ-инфекции. При отрицательном результате иммуноблоттинга результаты ИФА считают ложнопо-ложительными и исключают диагноз ВИЧ-инфекции. Если результат иммуноблоттинга сомнителен, то приблизительно через месяц это исследование повторяют. Кроме того, дополнительно можно провести исследования с помощью ло-вушечного ИФА на антиген р24 или ПЦР для определения вирусной ДНК или РНК. Если результаты дополнительных исследований отрицательны, а окраска полос при повторном иммуноблоттинге не претерпела изменений, то диагноз ВИЧ-инфекции исключают. При усилении окраски полос или положительном результате хотя бы одного из дополнительных исследований ставят предположительный диагноз ВИЧ-инфекции, и иммуноблоттинг проводят повторно через несколько месяцев. Положительный результат иммуноблоттинга подтверждает диагноз. Существуют разнообразные методы прямого выявления ВИЧ и его компонентов (табл. 308.10). Как уже говорилось, эти методы используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции при сомнительных результатах иммуноблоттинга. Кроме того, некоторые из этих методов позволяют оценить эффективность антиретровирусного лечения. Наиболее простой из них — ловушечный ИФА на антиген р24. Это модификация ИФА, при которой антитела к вирусному белку р24 иммобилизируют на твердой подложке. При добавлении сыворотки больного происходит сорбция антигена (белка р24) на этих антителах. Свободный белок р24 выявлен приблизительно у 30% ВИЧ-инфицированных. Однако в крови белок р24 находится не только в свободной форме, но и в виде иммунных комплексов, поэтому обработка проб слабой кислотой с целью расщепления иммунных комплексов увеличивает этот показатель до 50%. В течение нескольких недель после заражения, до развития гуморального иммунного ответа на ВИЧ, концентрация белка р24 в сыворотке ВИЧ-инфицированных резко возрастает. При появлении в крови антител к белку р24 концентрация этого антигена снижается. На поздних стадиях ВИЧ-инфекции, сопровождающихся выраженной виремией, концентрация белка р24 (особенно в составе иммунных комплексов) в сыворотке вновь возрастает. Патогенетическая роль свободного белка р24 неизвестна, однако показано, что при его наличии в сыворотке во время бессимптомной фазы риск развития СПИДа в течение следующих 3 лет в среднем в три раза выше, чем в отсутствие этого антигена, несмотря на примерно одинаковое исходное число лимфоцитов CD4 у всех больных. Кроме того, в ходе клинических испытаний установлено, что антиретровирусное лечение приводит к снижению концентрации белка р24 в сыворотке ВИЧ-инфицированных. Однако целесообразность определения этого антигена для оценки эффективности антиретровирусного лечения не доказана — существуют гораздо более чувствительные методы ПЦР и разветвленной ДНК (см. ниже). В настоящее время ловушечный ИФА на антиген р24 с успехом применяется для диагностики ВИЧ-инфекции во время острой лихорадочной фазы, когда концентрация этого антигена высока, а антител к белкам ВИЧ, наоборот, низка. Кроме того, в США этот метод используется вместе с ИФА для проверки донорской крови на ВИЧ. Методы, основанные на ПЦР, получили широкое распространение в диагностике инфекционных заболеваний. Благодаря применению этих методов удалось достичь значительного прогресса в понимании патогенеза ВИЧ-инфек- Глава 308 ции. Несмотря на то что высокая чувствительность ПЦР часто служит причиной ложноположительных результатов, в настоящее время эти методы признаны эталонными для диагностики ВИЧ-инфекции, особенно у новорожденных из группы риска. Существует два основных метода, позволяющие выявить соответственно провирусную ДНК и вирусную РНК. Первый метод заключается в следующем: 1) из предварительно лизированных лимфоцитов и моноцитов крови выделяют ДНК; 2) с помощью специально подобранных праймеров амплифицируют (синтезируют множество копий) консервативный участокпровируснойДНК, причем чаще всего используют пары праймеров, комплементарные последовательностям длинных концевых повторов и гена gag; 3) полученные копии выявляют с помощью гибридиза-ционного анализа. Положительные и отрицательные кон-троли позволяют исключить ошибочные результаты ПЦР, обусловленные загрязнением исследуемой пробы и нарушением процесса амплификации ДНК. Метод позволяет обнаружить одну провирусную ДНК на 10 000—100 000 клеток и используется для диагностики ВИЧ-инфекции (особенно в первые 1—3 мес после заражения, пока антитела к ВИЧ отсутствуют), а также для анализа нуклеотидных последовательностей провирусной ДНК и выявления штаммов ВИЧ, устойчивых к антиретровирусным средствам. Второй метод заключается в следующем: 1) выделяют всю РНК, присутствующую в исследуемой сыворотке; 2) с помощью обратной транскриптазы получают смесь разных кДНК; 3) проводят ПЦР, добавляя к этой смеси праймеры, комплементарные участкам вирусной кДНК; 4) полученные копии выявляют с помощью гибридизационного анализа. Метод используют как для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, так и для измерения концентрации вирусной РНК в сыворотке (см. ниже). Лабораторные методы, основанные на ПЦР, используют при положительных (или сомнительных) результатах ИФА и сомнительных результатах иммуноблоттинга, а также в тех случаях, когда серологическое исследование нецелесообразно (например, при диагностике ВИЧ-инфекции у больных с гипогаммаглобулинемией). Однако из-за высокой стоимости и большого количества ложноположительных результатов, обусловленных загрязнением исследуемых проб, эти методы применяют лишь в тех случаях, когда стандартное серологическое исследование не позволяет с уверенностью поставить или исключить диагноз ВИЧ-инфекции. Дата добавления: 2015-05-19 | Просмотры: 1076 | Нарушение авторских прав |
