АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Диагностика ВИЧ-инфекции

Прочитайте:
  1. E. АИВ инфекциясына серодиагностика
  2. II. Диагностика
  3. II. Диагностика
  4. II. Диагностика
  5. II. Диагностика
  6. III. Диагностика лекарственной аллергии
  7. III. Диагностика острого панкреатита.
  8. III. Лабораторная диагностика
  9. III. Лабораторная диагностика хронического панкреатита
  10. IV) Травматические повреждения периферический нервов и сплетений. Клиника, диагностика, лечение, виды операций.

Основные методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфек­ции включают выявление антител к вирусу, вирусных анти­генов и выделение вируса в культуре клеток. Как уже гово­рилось, антитела к вирусу появляются в сыворотке боль­шинства ВИЧ-инфицированных через 4—8 нед после зара­жения.

Стандартным методом диагностики ВИЧ-инфекции слу­жит определение антител к ВИЧ с помощью ИФА. Этот ме­тод очень надежен, его чувствительность составляет более 99,5%. В большинстве диагностических лабораторий для про­ведения этого анализа используются коммерческие наборы, позволяющие определять антитела как к ВИЧ-1, так и к ВИЧ-2, поскольку в состав наборов входят естественные или рекомбинантные антигены ВИЧ обоих типов. Набор


антигенов в этих наборах постоянно обновляется, что по­зволяет повысить их чувствительность при определении ан­тител к новым штаммам ВИЧ, например штаммам группы О (рис. 308.5). Результаты анализа обычно расценивают как положительные, отрицательные или сомнительные. Однако специфичность этого метода мала. Так, при обследовании лиц из группы низкого риска ВИЧ-инфекции (например, доноров крови) оказалось, что лишь 13% людей с положи­тельными результатами ИФА были действительно инфици­рованы ВИЧ. Причинами ложноположительного результата могут быть наличие в сыворотке антител к HLA класса II и другим аутоантигенам, болезни печени или недавняя вакци­нация против гриппа. Таким образом, все случаи положи­тельного и сомнительного результатов ИФА должны быть проверены с помощью более специфичных методов.

Для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции чаще всего используют иммуноблоттинг (рис. 308.19). Поскольку этот метод позволяет разделить антигены по молекулярной мас­се, то удается одновременно обнаружить антитела к несколь­ким антигенам ВИЧ. О наличии антител к определенному антигену судят по появлению окрашенной полосы на участ­ке мембраны, где локализован данный антиген. При отри­цательном результате иммуноблоттинга (отсутствии окра­шенных полос) положительные и сомнительные результаты ИФА расцениваются как ложноположительные. Если на мембране обнаруживают три полосы, соответствующие про­дуктам разных генов (gag, pol и env), то результат иммуноб­лоттинга — заведомо положительный. Однако в большинст­ве лабораторий результаты иммуноблоттинга оценивают в соответствии с критериями, принятыми Ассоциацией руко­водителей медицинских лабораторий США и Центром по контролю заболеваемости: результат иммуноблоттинга счи­тается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ — р24, gp41 и gp 120 (или gp 160). Положительный результат им-


 


 

ааа

YYY

ААА

ААА

ААА

ААА

ААА

ААА


ААА ААА

YYY

YYY

АА'Х ААА

АА'Х ААА

АА'Х ААА

АА'Х ААА

АХ'Х ААА


-рбб-

pal

. р31.

дад


-р55-

I

p24- H

 

-р18-


-160 --120 -



Рисунок 308.19. Иммуноблоттинг. А. Принцип метода. Б. Результаты им­муноблоттинга. Для выявления анти­тел к ВИЧ использовали антигены ВИЧ-1. В сыворотке здорового чело­века, иммунизированного белками внешней оболочки ВИЧ, присутству­ют антитела только к этим вирусным белкам. В сыворотке ВИЧ-инфициро­ванного, зараженного ВИЧ-2, присут­ствуют антитела, перекрестно реаги­рующие с продуктами генов pol и gag ВИЧ-1.


 


1.Электрофоретическое разделение белков
ВИЧ-1 по их молекулярной массе

2. Перенос вирусных белков на мембрану и ее
инкубация в присутствии исследуемой

сыворотки

3. Инкубация мембраны в присутствии антител
к человеческим иммуноглобулинам,
конъюгированным с ферментом

4. Появление окрашенных попос на мембране
после ее инкубации в присутствии субстрата
фермента


 

1.Положительный результату ВИЧ-
инфицированного, зараженного ВИЧ-1

2. Результат у здорового человека,
иммунизированного белками внешней
оболочки ВИЧ-1

3. Сомнительный результат у ВИЧ-
инфицированного, зараженного ВИЧ-2

4. Сомнительный результат при наличии в
исследуемой сыворотке антител,
перекрестно реагирующих с вирусным
антигеном р24

5. Отрицательный результат



Диагноз ВИЧ-инфекции подтвержден

Диагноз ВИЧ-инфекции исключен

1 Если результат повторного иммуноблоттинга остается сомнительным, диагноз ВИЧ-инфекции маловероятен. Для окончательного исключения этого диагноза иммуноблоттинг повторяют еще два раза с интервалом в 3 мес (вместо иммуноблоттинга можно использовать методы определения антигена р24 или вирусной РНК).

Рисунок 308.20. Диагностический алгоритм при подозрении на ВИЧ-инфекцию. Результаты: (+) — положительный; (—) — отрицатель­ный; (+/—) — сомнительный.

муноблоттинга подтверждает диагноз ВИЧ-инфекции. Ес­ли результат иммуноблоттинга нельзя расценить как поло­жительный или отрицательный, его считают сомнительным. Наиболее вероятная причина сомнительного результата — наличие в сыворотке здорового человека антигенов, пере­крестно реагирующих с антителами к каким-либо антиге­нам ВИЧ, чаще всего с антителами к р24 и р55. Сомнитель­ный результат иммуноблоттинга может быть получен и при обследовании ВИЧ-инфицированных, у которых гумораль­ный иммунный ответ на вирус находится на ранней стадии развития. В связи с этим при получении сомнительных ре­зультатов иммуноблоттинга его обязательно повторяют че­рез месяц. Для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции мож­но использовать также ловушечный ИФА на антиген р24 и методы выявления вирусной РНК (см. ниже). Иммуноблот­тинг прекрасно подходит для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции, но не годится как предварительный метод диаг­ностики: у 20—30% лиц с отрицательными результатами ИФА и ПЦР при иммуноблоттинге обнаруживается как ми­нимум одна окрашенная полоса. Обычно эти полосы окра­шены слабо. Они образуются в результате перекрестных ре­акций с антигенами, не связанными с ВИЧ. Тем не менее при получении таких результатов иммуноблоттинга необхо­димы дальнейшие исследования (ПЦР для выявления ви­русной РНК или ДНК, метод разветвленной ДНК или лову­шечный ИФА на антиген р24), поскольку они позволяют подтвердить диагноз ВИЧ-инфекции на самых ранних ста­диях.

Диагностический алгоритм при подозрении на ВИЧ-ин­фекцию приведен на рис. 308.20. В первую очередь проводят ИФА. Если результат исследования отрицателен и отсутст­вуют указания на возможность недавнего заражения (в тече­ние 3 мес перед обследованием), диагноз ВИЧ-инфекции исключают. Исследование повторяют при подозрении на недавнее заражение, а также при положительном (или со­мнительном) результате первого исследования. В послед­нем случае отрицательный результат двух последовательных исследований исключает диагноз ВИЧ-инфекции и свиде­тельствует о технических ошибках, допущенных при первом исследовании. Если результаты повторных ИФА положи-


 

 

ВИЧ-инфекция и СПИД

тельны или сомнительны, проводят иммуноблоттинг. Поло­жительный результат иммуноблоттинга служит подтвержде­нием диагноза ВИЧ-инфекции. При отрицательном резуль­тате иммуноблоттинга результаты ИФА считают ложнопо-ложительными и исключают диагноз ВИЧ-инфекции. Если результат иммуноблоттинга сомнителен, то приблизитель­но через месяц это исследование повторяют. Кроме того, до­полнительно можно провести исследования с помощью ло-вушечного ИФА на антиген р24 или ПЦР для определения вирусной ДНК или РНК. Если результаты дополнительных исследований отрицательны, а окраска полос при повтор­ном иммуноблоттинге не претерпела изменений, то диагноз ВИЧ-инфекции исключают. При усилении окраски полос или положительном результате хотя бы одного из дополни­тельных исследований ставят предположительный диагноз ВИЧ-инфекции, и иммуноблоттинг проводят повторно че­рез несколько месяцев. Положительный результат иммуноб­лоттинга подтверждает диагноз.

Существуют разнообразные методы прямого выявления ВИЧ и его компонентов (табл. 308.10). Как уже говорилось, эти методы используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции при сомнительных результатах иммуноблоттин­га. Кроме того, некоторые из этих методов позволяют оце­нить эффективность антиретровирусного лечения. Наибо­лее простой из них — ловушечный ИФА на антиген р24. Это модификация ИФА, при которой антитела к вирусному бел­ку р24 иммобилизируют на твердой подложке. При добавле­нии сыворотки больного происходит сорбция антигена (бел­ка р24) на этих антителах. Свободный белок р24 выявлен приблизительно у 30% ВИЧ-инфицированных. Однако в крови белок р24 находится не только в свободной форме, но и в виде иммунных комплексов, поэтому обработка проб слабой кислотой с целью расщепления иммунных комплек­сов увеличивает этот показатель до 50%. В течение несколь­ких недель после заражения, до развития гуморального им­мунного ответа на ВИЧ, концентрация белка р24 в сыворот­ке ВИЧ-инфицированных резко возрастает. При появлении в крови антител к белку р24 концентрация этого антигена снижается. На поздних стадиях ВИЧ-инфекции, сопровож­дающихся выраженной виремией, концентрация белка р24 (особенно в составе иммунных комплексов) в сыворотке вновь возрастает. Патогенетическая роль свободного бел­ка р24 неизвестна, однако показано, что при его наличии в сыворотке во время бессимптомной фазы риск развития СПИДа в течение следующих 3 лет в среднем в три раза вы­ше, чем в отсутствие этого антигена, несмотря на примерно одинаковое исходное число лимфоцитов CD4 у всех боль­ных. Кроме того, в ходе клинических испытаний установле­но, что антиретровирусное лечение приводит к снижению концентрации белка р24 в сыворотке ВИЧ-инфицирован­ных. Однако целесообразность определения этого антигена для оценки эффективности антиретровирусного лечения не доказана — существуют гораздо более чувствительные мето­ды ПЦР и разветвленной ДНК (см. ниже). В настоящее время ловушечный ИФА на антиген р24 с успехом применяется для диагностики ВИЧ-инфекции во время острой лихорадочной фазы, когда концентрация этого антигена высока, а антител к белкам ВИЧ, наоборот, низка. Кроме того, в США этот ме­тод используется вместе с ИФА для проверки донорской крови на ВИЧ.

Методы, основанные на ПЦР, получили широкое распро­странение в диагностике инфекционных заболеваний. Бла­годаря применению этих методов удалось достичь значи­тельного прогресса в понимании патогенеза ВИЧ-инфек-


 

Глава 308

ции. Несмотря на то что высокая чувствительность ПЦР часто служит причиной ложноположительных результатов, в настоящее время эти методы признаны эталонными для диагностики ВИЧ-инфекции, особенно у новорожденных из группы риска. Существует два основных метода, позво­ляющие выявить соответственно провирусную ДНК и ви­русную РНК. Первый метод заключается в следующем: 1) из предварительно лизированных лимфоцитов и моноцитов крови выделяют ДНК; 2) с помощью специально подобран­ных праймеров амплифицируют (синтезируют множество копий) консервативный участокпровируснойДНК, причем чаще всего используют пары праймеров, комплементарные последовательностям длинных концевых повторов и гена gag; 3) полученные копии выявляют с помощью гибридиза-ционного анализа. Положительные и отрицательные кон-троли позволяют исключить ошибочные результаты ПЦР, обусловленные загрязнением исследуемой пробы и наруше­нием процесса амплификации ДНК. Метод позволяет обна­ружить одну провирусную ДНК на 10 000—100 000 клеток и используется для диагностики ВИЧ-инфекции (особенно в первые 1—3 мес после заражения, пока антитела к ВИЧ от­сутствуют), а также для анализа нуклеотидных последова­тельностей провирусной ДНК и выявления штаммов ВИЧ, устойчивых к антиретровирусным средствам. Второй метод заключается в следующем: 1) выделяют всю РНК, присутст­вующую в исследуемой сыворотке; 2) с помощью обратной транскриптазы получают смесь разных кДНК; 3) проводят ПЦР, добавляя к этой смеси праймеры, комплементарные участкам вирусной кДНК; 4) полученные копии выявляют с помощью гибридизационного анализа. Метод используют как для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, так и для из­мерения концентрации вирусной РНК в сыворотке (см. ни­же). Лабораторные методы, основанные на ПЦР, использу­ют при положительных (или сомнительных) результатах ИФА и сомнительных результатах иммуноблоттинга, а так­же в тех случаях, когда серологическое исследование неце­лесообразно (например, при диагностике ВИЧ-инфекции у больных с гипогаммаглобулинемией). Однако из-за высокой стоимости и большого количества ложноположительных ре­зультатов, обусловленных загрязнением исследуемых проб, эти методы применяют лишь в тех случаях, когда стандартное серологическое исследование не позволяет с уверенностью поставить или исключить диагноз ВИЧ-инфекции.


Дата добавления: 2015-05-19 | Просмотры: 1071 | Нарушение авторских прав



1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 |



При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.005 сек.)