АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

АДСОРБЦІЙНО-ХРОМАТОГРАФІЧНІ МЕТОДИ

Ці методи широко запроваджуються у виробництві ферментів, гормонів, рекомбінантних ДНК; для одержання БАР рослинного і тваринного походження, до чистоти яких ставлять особливо жорсткі вимоги, традиційна технологія очищення не під­ходить. У промисловому виробництві успішно себе зарекомен­дувала розподільна хромато-

графія, самий надійний і ефек­тивний метод очищення. Нині широко використовують безпе­рервну колонкову і ступінчасту хроматографію. Декілька відо­мих хроматографічних методів, побудованих на різних параме­трах розділюваних молекул, на­ведено у табл. 8.1.

8.4.1. ІОНООБМІННА ХРОМАТОГРАФІЯ

Хроматографія БАР за допомогою іонообмінних сор­бентів, названа іонообмінною,— це один із методів розділення, які мають найбільш тривалу історію розвитку. Тепер промислова іоно­обмінна хроматографія стала однією з найважливіших технологіч­них стадій одержання комерційно прийнятних кількостей БАР.

В основі іонообмінної хроматографії лежить реакція обміну між нерухомим твердим іонообмінним сорбентом і розчиненою у розчиннику речовиною.

8.4.2. ІОНООБМІННІ МАТЕРІАЛИ

Іонообмінні сорбенти — це нерозчинні у воді речо­вини, синтетичні або природні, які містять у своїй структурі іоно-генні групи кислого (катіоніти) або основного (аніоніти) характе­ру. Іони водню (при наявності катіонітів) або іони гідроксилу (при наявності аніонітів), що входять до складу іоногенних груп, мо­жуть обмінюватися з катіонами, які знаходяться в розчині, або аніонами за реакціями, утворюючи солеві форми іонітів:

де R — високомолекулярний аніон катіоніту або високомолеку-лярний катіон аніоніту. При взаємодії катіонітів у Н-формі з розчинами основ, а аніо­нітів в ОН-формі з розчинами кислот також відбувається соле-утворення у фазі іоніту поряд з нейтралізацією розчинів через утворення води за реакціями:

Таким чином, катіоніти в Н-формі представлені нерозчинни­ми кислотами, а аніоніти в ОН-формі — нерозчинними основами.

Природні іонообмінники — мінерали типу монтморилонітів, каолінітів та ін.

Синтетичні органічні іонообмінники — це здебільшого про­дукти кополімерізації або поліконденсації різних органічних ре­човин, в які введені іоногенні групи: —S0₃H, —COOH, —Р0₃Н та інші за наявним складом катіонітів (відповідно до цих груп каті­оніти називаються сульфокатіонітами, карбоксильними або фос­фатними); =NHJ, (CH₃)₃N⁺, =S⁺ та інші за наявним складом ані­онітів. Залежно від здатності іоногенних груп до дисоціації катіоніти поділяються на сильно- і слабокислі, а аніоніти — на сильно- і слабоосновні. Існують іоніти, які містять у своїй струк-

турі іоногенні групи різної природи, так звані поліфункціональні іоніти, наприклад катіоніт КУ-1, залежно від pH розчину обмін може відбуватися з різними групами. Полімерізаційні іоніти здебільшого являють собою круглі гранули різного діаметру. При одній і тій ж іоногенній групі і основному компонентові матриці вони відрізняються кількістю зшиваючого агента, наприклад, ка-тіоніти КУ-2-8 і КУ-2-20. Остання цифра характеризує кількість дивінілбензену, уведеного в реакційну суміш при кополімеріза-ції. Різниця в кількості зшиваючого агента суттєво позначається на такій властивості іонітів, як їх набухлість, а це, у свою чергу, позначається на вибірковості і кінетиці обміну.

Розвиток синтезу органічних іонітів привів до створення низ­ки специфічних їх різновидів: іонітів, які містять як кислі, так і основні іоногенні групи (так звані амфотерні іоніти); іонітів із підвищеною гідрофобністю поверхні гранул (олеофільні іоніти); іонітів, які мають пористу структуру за рахунок уведення при їх синтезі речовин-пароутворників (макропористі іоніти) і т. д. Сьо­годні випускають майже 600 найменувань різних синтетичних органічних іонітів.

Особливим родом іонообмінних матеріалів є іонообмінні мем­брани, які складаються із іонітів. Мембрани бувають гетерогенні, тобто коли дрібносумельгенний іоніт нанесений на полімерну інди­ферентну підкладку, і гомогенні, що являють собою іоніт у вигляді суцільного листа. Катіонообмінні мембрани мають властивість про­пускати через себе (знаходячись у розчині) при накладенні елект­ричного поля тільки катіони, аніонообмінні — тільки аніони.

8.4.3. ОСНОВНІ РОЗМІРИ, ЯКІ ХАРАКТЕРИЗУЮТЬ ІОНООБМІННИЙ ПРОЦЕС. ОБМІН ОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН

Основною практичною величиною,яка характеризує ефективність застосування іонітів для розділення суміші іонів, є концентраційна константа рівноваги відповідної іонообмінної реакції або коефіцієнт вибірковості і£_виб.

де в квадратних дужках наведена концентрація обмінюючих іо­нів в іоніті, а в круглих — концентрація відповідних іонів у роз­чині.

При і£_виб = 1 обмін не вибірковий. Якщо іС_виб < 1, це значить, що Ме⁺ має меншу спорідненість з іонітом, ніж іон Н⁺. Якщо К_вп6 > 1, то більша вибірковість поглинання іона з розчину.

Для здійснення іонообмінного поглинання іон з розчину повин­ний продифундувати до частинки іоніту, потім продифундувати усередині неї до іоногенної групи і, нарешті, має відбутися сама іонообмінна реакція.

Залежно від властивостей і структури матриці іоніту, концен­трації іонів у розчині, їх розмірів і будови, а також заповнення ними іоногенних груп іоніту, стадією, що визначає швидкість іо­нообмінного процесу, може бути або зовнішня, або внутрішня дифузія. Швидкість сорбції у разі зовнішньої дифузії при ліній­ній ізотермії сорбції визначається за рівнянням:

де а — концентрація іона в іоніті в момент часу t;

P — кінетичний коефіцієнт, P = 3Dj/(5 • r_Q);

D_x — коефіцієнт зовнішньої дифузії;

5 — товщина плівки рідини навколо зерна;

r₀ — радіус зерна іоніту;

С₀ — вихідна концентрація іона в розчині;

C — концентрація іона в розчині в момент часу t, рівноважна з а.

Швидкість сорбції при внутрішній дифузії виражається рів­нянням:

де р₂ — кінетичний коефіцієнт, р₂ = ЗБ₂/г|;

D₂ — коефіцієнт внутрішньої дифузії;

г₀ — радіус зерна;

а₀ — концентрація іонів у іоніті, рівноважна з С₀.

3 наведених формул випливає, що для визначення швидкості іонообмінного процесу дуже суттєвим є значення величин коефі­цієнтів дифузії, які характеризують іонообмінну систему. Для технології важливо встановити, який із процесів відповідальний за швидкість сумарного процесу, тому що можливості прискорен­ня поглинання при визначальній ролі зовнішньої або внутрішньої дифузії різні.

Іонообмінна хроматографія — один із найбільш застосову­ваних методів розділення і очищення білків, завдяки високій здат­ності сорбентів зв'язувати білок (50,0 г білка на 1 л іонообмінної смоли) та можливості використання різних методів елюювання (безперервного і ступінчастого).

Основний принцип іонного обміну можна проілюструвати рис. 8.1. На першому етапі водний розчин суміші білків пропус­кають через колонку з нерухомим шаром іонообмінної смоли.

Одним з найбільш популярним іонообмінником, що використо­вується для очищення білків, є карбоксиметилцелюлоза — катіо-нообмінна смола, одержана за допомогою введення карбоксимети-льних груп (несуть негативний заряд) у целюлозну матрицю. Білки в катіонній формі (несуть позитивний заряд) зв'язуються з цією смолою електростатичними силами. Потім адсорбований білок елю-юють буферними розчинами зі зростаючим значенням pH.

Поступова зміна властивостей елюента призводить до того, що слабозв'язані з носієм білки десорбуються першими, а потім — усі більш міцно зв'язані з іонообмінником. Отже, рухома фаза, яка до введення в колонку взагалі не містила білків, на виході з колонки буде збагачена десорбованими білками. Отриманий при промиванні колонки елюат збирають у вигляді фракцій невели­кого об'єму. Аналогічно здійснюють і хроматографію на іоно­обмінних смолах — діетиламіноцелюлозі.

ній промисловості найбільш широкого застосування набули сефа­декси G₂₅ і G₅₀ у вигляді гранул із діаметром пор 30—100 мкм і 20—80 мкм відповідно. Проникність мембрани для кожної з ре­човин суміші визначається розміром молекули. У зв'язку з цим гель-хроматографію іноді називають молекулярним просіюванням. Певний об'єм розчинника вимиває з колонки речовини з більшою молекулярною масою (сефадекси G₂₅) i з меншою молекулярною масою (сефадекси G₅₀).

Основною величиною, яка визначається в гель-хроматографії, є утримуваний об'єм V_e:

де V_Q і V — об'єми рухомої і нерухомої хроматографічних фаз; K_d — коефіцієнт розподілу, який залежить від співвідно­шення розмірів молекул і пор. Гель-фільтрація — метод, малочутливий до складу зразка, за­стосовується в основному при видаленні осадника, заміні буфера і знесоленні.

ГЕЛЬ-ФІЛЬТРАЦІЯ

Гель-фільтрація, або хроматографія на молекуляр­них ситах, дозволяє розділяти речовини з різними молекулярни­ми масами. У цьому випадку насадка колонки складається з час­тинок гелю з певним діаметром пор. Якщо розмір молекул більший від діаметра пор, то вони не можуть дифундувати в гель і швидко проходять через колонку, тоді як молекули меншого розміру про­никають у гель і тому рухаються повільніше (рис. 8.2).

Як сорбент зазвичай використовують сефадекси G₂₅, G₅₀, G₇₅, G₁₀₀, що складаються з полімерних ланцюгів полісахариду дек-страну, з'єднані через певні проміжки поперечними зв'язками і утворюють своєрідні молекулярні сита. У хіміко-фармацевтич-

Дата добавления: 2016-03-26 | Просмотры: 514 | Нарушение авторских прав