АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Системи очищення повітря

Для забезпечення киснем культури мікроорганізмів в умовах аеробного процесу при глибинній ферментації через оди­ницю об'єму живильного середовища за 1 хв необхідно продути 0,5—2 об'єми повітря. Його треба очистити від механічних части­нок, мікроорганізмів і хімічних речовин перед введенням у фер­ментатор. Для очищення повітря зазвичай застосовують фільтра­цію (рис. 12.2).

Повітря подають у систему під тиском 0,2 МПа. Для створен­ня тиску найчастіше використовують турбо- або поршневі комп­ресори. Перед подачею в компресор повітря очищується від грубих частинок на масляних фільтрах. У ферментаторі воно проходить

через фільтри: спочатку через загальний, потім через індивідуаль­ний. Ці фільтри виконують функцію холодної стерилізації повіт­ря. Фільтри заповнюють гранульованим зернистим або волокнис­тим фільтрувальним матеріалом, використовуючи гранульоване вугілля і скловату, діаметр волокон яких 18 мкм. Останнім часом почали використовувати спеціальне бактерицидне волокно. Товщи­на фільтрувального шару зазвичай складає 0,4—0,75 м. Індиві­дуальні фільтри часто заповнюють скловатою або бавовняною ва­тою, активованим вугіллям.

Тривалість експлуатації фільтрів 1—1,5 год при температурі 120— 126 °С. Після стерилізації їх сушать у потоці сухого повітря протя­гом 2—3 год. Фільтрувальний матеріал в індивідуальних фільтрах заміняють через 1—2 місяці, у загальних — через 6—8 місяців.

Затримуюча спроможність фільтра:

де N^ — кількість мікроорганізмів у потоці атмосферного повіт­ря, що наступає;

N₂ — теж саме на виході з фільтру.

Як фільтрувальний матеріал можуть бути використані і спе­ціально виготовлені пластинки, наприклад полівінілові, завтовш­ки 1—2 мм із порами певного розміру. В обслуговуванні пластин­часті фільтри простіші, ніж фільтри із скловолокном.

Системи контролю і керування

Щоб процес ферментації зробити керованим, опера­тор має постійно отримувати інформацію про хід розвитку біо­логічного агента і динаміки середовища культивування. Основні показники, що характеризують ферментаційний процес такі:

Фізичні показники: температура; тиск; введена потужність; частота обертання мішалки; піноутворення; швидкість потоку газу (повітря); швидкість потоку середовища; в'язкість; турбулентність.

Хімічні показники: pH середовища; окисно-відновний потен­ціал; вміст розчиненого 0₂ і С0₂; вміст 0₂ і С0₂ у газі; вміст вугле­цю; вміст попередника: азоту, фосфору; Mg²⁺, K⁺, Ca²⁺, Na⁺, Fe²⁺,

SO^2- тощо.

Найважливішим показником процесу ферментації є вміст біо­маси, субстрату, продукту і відсутність забруднення сторонньою

мікрофлорою.

Фізичний стан продуцента характеризує питома швидкість росту, його морфологічний стан (розмір клітин, кількість клітин, що діляться,), а також багато біохімічних показників (вміст PHK, ДН, НАД, НАДН, ATP, AMP, активність ключових ферментів). Більшість хімічних показників визначають, періодично від­бираючи пробу, фізичні показники — постійно за допомогою вмо­нтованих у ферментатор датчиків.

Для біотехнічних процесів істотне значення має не тільки температура і pH середовища, але й вміст розчиненого кисню. Для визначення pH і розчи­неного кисню застосовують сте­рильні електроди, вмонтовані безпосередньо у ферментатор.

Для визначення розчинено­го кисню застосовують ампер­метричні срібно-свинцеві або срібно-золоті електроди.

Істотний вплив на хід про­цесу ферментації має ступінь піноутворення субстрату. Для субстратів, що дуже піняться, використовують автоматизова­ні системи піногасіння, що включають як хімічні, так і ме­ханічні засоби (рис. 12.3).

Сучасний біотехнічний про­цес немислимий без застосуван­ня ЕОМ для керування про­цесом ферментації: підтримка оптимальної величини pH, тем­ператури, піноутворення, час­тоти обертання мішалки, кіль­кості розчинного кисню, швид­кості подачі субстрату тощо (рис. 12.4).

12.3.3. ГЛИБИННИЙ АЕРОБНИЙ ПЕРІОДИЧНИЙ ПРОЦЕС

Цей відносно сучасний метод має великі переваги впорівнянні з більш ранніми методами поверхневого культиву­вання. Застосування глибинного методу дозволяє підвищити ефек­тивність використання виробничих площ, збільшити масштаби виробництва, механізувати трудомісткі роботи і майже цілком ав­томатизувати технологічний процес одержання біопродукту. Крім того, вихід продукту підвищується, а небезпека зараження змен­шується, хоча технології поверхневого способу культивування більш економні, оскільки при його застосуванні собівартість про­дукту і витрата електроенергії значно менші.

Більшість промислових ферментацій здійснюють періодичним способом. При глибинному способі культивування розмноження посівного матеріалу зазвичай відбувається у дві стадії: у цеху чи­стої культури та у відділенні інокуляції. Кількість живильного середовища в апараті не повинна перевищувати 60 % від загаль­ного об'єму. Якщо культуру в інокулятор вносять із колб, то кіль­кість посівного матеріалу складає приблизно 0,1 % від об'єму середовища. Така невелика кількість посівного матеріалу вима­гає тривалого періоду інокуляції (2—4 доби). Для посівних фер­ментаторів використовують 10—12 % інокуляту від загального об'єму середовища, тому за тривалістю приготування посівного матеріалу треба стежити, щоб в апараті був оптимальний режим культивування. Три рази в сушці збирають зразки для мікробіо-

логічного і біохімічного аналізів. Посівний матеріал для основної ферментації готують у кількості 5—20 % від об'єму використову­ваного живильного середовища.

12.3.4. ГЛИБИННИЙ БЕЗПЕРЕРВНИЙ ПРОЦЕС

Процес ферментації може бути гомогенно або гетеро­генно безперервним.

При гомогенно безперервному процесі в апараті, де відбува­ється інтенсивне перемішування, усі параметри незмінні в часі. При гетерогенно безперервному процесі декілька ферментаторів з'єднані в батарею. Живильне середовище надходить у перший апарат, готова культуральна рідина витікає з останнього.

Культивування мікроорганізмів у протоці через систему тру­бок відбувається також за принципом гетерогенно безперервного процесу. У цьому разі має місце безперервний потік живильного середовища, але клітини не забезпечені постійними умовами рос­ту (скільки апаратів, стільки й умов культивування). При безпе­рервному культивуванні мікроорганізмів важливо регулювати швидкості притікання живильного середовища і витікання куль-туральної рідини, щоб запобігти вимиванню культури із системи. У стерильних умовах безперервний проточний метод забезпечує зберігання культури у фізіологічно активному стані тривалий час.

Безперервний процес можна використовувати в тому разі, якщо культура при тривалому вирощуванні не втрачає здатності до син­тезу (мутації, реверсії). При розробці методу безперервного куль­тивування мікроорганізмів необхідно встановити оптимальний склад середовища, швидкість подавання живильного середовища, температуру, pH, аерацію тощо.

12.3.5. ТВЕРДОФАЗНА ФЕРМЕНТАЦІЯ

Культивування на поверхні твердого середовища, як правило, здійснюють у зволоженому твердому, сипучому або пас­топодібному середовищі, вологість якого становить 30—80 %. Якщо субстрат сипучий, то його окремі тверді частинки добре контакту­ють із повітрям. Ріст мікроорганізмів у цьому разі відбувається головним чином на поверхні твердих частинок, а також у порах, заповнених водою або повітрям. Забезпечення мікроорганізмів ки­снем утруднюється із зволоженням шару субстрату. Перемішуван­ня шару не допускається, якщо культивуються міцеляльні мікро­організми. Інша проблема при твердофазній ферментації — відведення теплоти і підтримка сталої тёмператури в усьому фер­ментаційному середовищі.

Метод твердофазної ферментації широко використовують в Японії для виробництва грибкових ферментів кислоти лимонної.

У Німеччині, Франції, Великій Британії від нього відмовилися, оскільки він вимагає занадто великих площ для експлуатації. Крім того важко запобігти зараженню мікроорганізмами, а вихід про­дукту біосинтезу невеликий.

Наприклад, у виробництві грибкової амілази головним ком­понентом живильного середовища є суміш пшеничних висівок і крохмалю, іноді до них додають білкові відходи, солодові па­ростки, одержані у виробництві пива, соєву муку і т. ін.

Для вирощування виробничої культури компоненти живильно­го середовища змішують, розподіляють тонким шаром у кюветах, зволожують міцеляльним розчином, який містить невелику кіль­кість кислоти хлороводневої, стерилізують при тискові 0,15 МПа протягом 1 год або гострою парою протягом 30 хв, а потім охо­лоджують.

В охолоджене до 35 °С живильне середовище вносять суспен­зію спор Aspergillus oryzae.

Стерильне, засіяне спорами Aspergillus oryzae живильне сере­довище в кюветах поміщають у камери для вирощування, в які подають очищене повітря, з певною температурою і відносною вологістю. Через 30—36 год інкубації для культури гриба Aspergillus oryzae в цих камерах при температурі 30 °С розвива­ється маса споротвірного міцелію. Масу знімають, висушують і здрібнюють для одержання сирої амілази або екстрагують для одержання очищеної амілази.

Схема вирощування культури Aspergillus oryzae наведена на рис. 12.5.

Технологічний процес поверхневого культивування цієї куль­тури складається із семи стадій:

1. Введення (одержання і підтримка росту) чистої культури в лабораторних умовах.

2. Приготування посівного матеріалу у відділенні чистої куль­тури.

3. Підготовка живильного середовища.

4. Вирощування виробничої культури.

5. Здрібнення готової культури.

6. Сушіння.

7. Розфасовка і упаковка готової продукції.

Описана схема поверхневого культивування вимагає значних затрат ручної праці. Більш сучасний варіант, запропонований для великотоннажного виробництва поверхневих культур плісеневих грибків, передбачає використання механізованих установок для вирощування із рознімними касетами і автоматичним розванта­женням. При цьому виникає можливість вирощувати за добу 1,2 т культури грибка. Така автоматизована система конструкції РНДІФС (рис. 12.6) існує на Вишньоволоцькому заводі фермент­них препаратів, який здійснює випуск лікарського ферментного препарату ораза з поверхневої культури грибка Aspergillus oryzae.

Підготовлене, простерилізоване і засіяне культурою грибка Aspergillus oryzae живильне середовище завантажується в камери вирощування і по рельсах подається у відділення вирощування, через дифузори до камер подається кондиціоноване повітря. Ae-рування культури здійснюється через вертикальні канали, що знаходяться між кюветами, і через отвори в стінках кювет. Сис­тема аерації розрахована на рециркуляцію та очищення потоку повітря, підсмоктування свіжого повітря і підтримку умов, що запобігають підсиханню культури, яка вирощується. Процес куль­тивування проводять протягом 42—46 год. Після цього проводять розвантаження камер вирощування на вібраційному столі, відді­ливши попередньо вертикальну стінку кювети.

Звільнена від культури камера переміщається по рельсах у відділення промивки, потім у стерилізатор і на вібраційний стіл для нового завантаження.

Використання механізованої лінії з вирощування культури грибка Aspergillus oryzae дає можливість підтримувати високий рівень стерильності, що дуже важливо для цілеспрямованого син­тезу амілази. У разі потреби можна оперативно локалізувати й ізолювати інфікований матеріал, виключаючи небезпеку зара­ження супутньою мікрофлорою інших камер.

Вирощену поверхневу культуру грибка передають на стадію ек­стракції, минаючи операцію сушіння, здрібнювання і фасування, які мають місце при серійному виробництві «амілорозину — П».

12.3.6. ГЛИБИННА ФЕРМЕНТАЦІЯ

Промисловий спосіб глибинної ферментації — склад­ний багатоступінчастий процес, який включає декілька техноло­гічних стадій. Нижче наведено основні з них.

12.3.6.1. ПЩГОТОВКА СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ПРОДУЦЕНТА ФЕРМЕНТУ I ПОСІВНОГО МАТЕРІАЛУ (I СТАДІЯ)

Приготування і стерилізація живильного середови­ща. Живильні середовища готують у спеціальних реакторах із міЩалками. Реактори, ферментатори, трубопроводи, арматуру найчастіше виготовляють із нержавіючої сталі, особливу увагу

звертають на зручність для стерилізації живильних середовищ, які використовують як для приготування чистої культури, так і в цехах основної ферментації. Середовище готують у сировинно­му або рецептурному цехах періодичним або безперервним мето­дом, в окремих випадках приготування і стерилізацію його здійс­нюють у ферментаторі.

На сучасних заводах застосовують безперервний метод приго­тування. Для цього використовують два резервуари: в один уво­дять вихідні речовини, а з іншого рідина витікає в змішувач без­перервної дії. А потім за допомогою насоса подається в колону для стерилізації, одночасно з якою використовуються парові ін­жектори, або теплообмінник — труба в трубі.

При роботі з вертикально встановленою стерилізаційною ко­лоною живильне середовище підводять знизу в простір між тру­бами. У верхню частину колони подають пару під тиском 0,3— 0,4 МПа. Швидкість потоку середовища вибирають таку, щоб кожна частинка живильного середовища знаходилася в зоні про­грівання відповідний час.

Якщо для стерилізації середовищ застосовують відносно висо­ку температуру (135 °С і вище) і об'єм витримування не переви­щує декілька десятків літрів, замість резервуарів використовують систему вертикально закріплених труб.

Теплообмінники пластинчастого типу використовують для нагрівання і охолодження середовища, процес стерилізації в них легко автоматизується.

Вибір апаратури, технології приготування і стерилізації жи­вильного середовища залежить від кількості і виду компонентів, які попередньо розчиняють у підігрітій або гарячій воді. Якщо за ступенем розчинності і стерилізації це можливо, то всі компоненти розчиняють в одному розчині та в певній послідов­ності. У противному разі їх розчиняють по окремих групах вихід­них речовин, виходячи з їхніх фізико-хімічних властивостей, стерилізують і з'єднують у змішувачі. Якщо середовище стери­лізують у невеликих кількостях, весь об'єм середовища доводять до температури 120 °С безпосередньо у ферментаторі або спеці­альних котлах-стерилізаторах, витримують протягом 30—60 хв (залежно від об'єму середовища і його складу) при 120 °С, а по­тім охолоджують до 27—30 °С.

Приготування посівного матеріалу. Штами-продуценти фер­ментів підприємства мікробіологічної або хіміко-фармацевтичної промисловості отримують з академій і університетів України і країн СНД у пробірках на зрізах агару або в ампулах. Кожна культура має паспорт із докладним описом морфології, характеристики се­редовища для культивування і збереження.

Перед початком технологічного процесу культуру розмножу­ють у стерильних умовах на оптимальному складі середовища і при дотриманні режиму вирощування (pH, температура, тривалість). 3 поверхні зрізу агару її стерильно переносять у колбу місткістю 100—200 мл та інкубують у термостаті. Тривалість кожної стадії вирощування 24 год.

Подальше розмноження посівного матеріалу зазвичай прово­дять у два етапи: в цеху чистої культури та у відділі інокуляції.

Апарати першого етапу вирощування часто називають іноку-ляторами, другого — посівними ферментаторами.

12.3.6.2. ОСНОВНА ФЕРМЕНТАЦІЯ. РОЗВИТОК ОРГАНІЗМУ-ПРОДУЦЕНТА ФЕРМЕНТУ У ФЕРМЕНТАТОРАХ (II СТАДІЯ)

Для стерильної основної ферментації широко вико­ристовують апарати об'ємом до 100 м³. Перед заповненням основ­ного ферментатора середовищем його і систему трубопроводів про­мивають водою, стерилізують гарячою парою під тиском, після чого заповнюють охолодженим живильним середовищем. Посів­ний матеріал для основної ферментації готують у кількості 5— 20 % від об'єму використовуваного середовища.

Процес розвитку мікроорганізму у ферментаторах проходить при суворому контролі всіх стадій, точному виконанні регламен­ту, умов розвитку організму-продуцента ферменту. Особлива ува­га приділяється підтримці заданої температури культивування, ак­тивної кислотності, pH середовища, ступеня аерації і швидкості обертання мішалки. Враховується споживання організмом основ­них поживних компонентів (джерела вуглецю, азоту та інших ви­дів сировини), пильно контролюється утворення ферменту.

Особливу увагу при розвитку продуцента у ферментаторах звер­тають на процес піногасіння. При продуванні повітря через куль­туру мікроорганізму часто відбувається сильне утворення піни, що суттєво порушує перебіг всього процесу розвитку продуцента ферменту у ферментаторі.

Основна причина появи великої кількості піни — наявність білкових речовин у середовищі і його висока в'язкість, зумовлена накопиченням біомаси.

Для боротьби з піноутворенням у ферментаторах використову­ють різні ПАР: рослинні олії (соєву, соняшникову), тваринний жир (лярд, кашалотовий жир), а іноді й мінеральні масла (вазелі­нове, парафінове), спирти і вищі жирні кислоти. Часто як піногас-ники використовують спеціально синтезовані речовини (силіко­ни, діазобутал-карбаміл та інші сполуки).

Багато речовин (олії, жири, спирти та ін.) — піногасників спо­живаються продуцентами ферментів як додаткові джерела вуг-

лецевого живлення. При цьому часто спостерігається підвищення виходу ферменту. Однак внесення піногасника знижує швидкість розчинення кисню, що у свою чергу може негативно вплинути на розвиток мікроорганізму і його біосинтетичну активність.

Іноді використовуються механічні способи піногасіння (відсмок­тування піни через спеціальні труби, руйнація бубльбашок піни сильними струменями рідини, пари або газу і аеродинамічні).

Ферментацію припиняють, коли в середовищі накопичується максимальна кількість корисного продукту. По закінченні проце­су культуральну рідину охолоджують до 5—10 °С для забезпечен­ня стабільності продукту і запобігання росту інших мікроорганіз­мів і перекачують у резервуари, з яких вона поступово подається на подальшу переробку (рис. 12.7).

12.3.6.3. ПОПЕРЕДНЯ ОБРОБКА КУЛЬТУРАЛЬНОЇ РІДИНИ
(III СТАДІЯ)

До складу культуральної рідини входять залишки використа­ного живильного середовища, синтезовані метаболіти і клітинна маса продуцента.

Для виділення продуктів біосинтезу використовують сепара­тори, осаджувальні центрифуги, фільтрпреси, вакуум-барабанні фільтри, ротаційно-вакуумні фільтри, відстійники.

Вибір обладнання залежить від масштабу ферментації, типу клітин, властивостей культуральної рідини, місця локалізації ферментів (у клітині, клітинній стінці, культуральній рідині).

Стадія попередньої обробки культуральної рідини в деяких технологіях виробництва ферментів включає операцію руйнації клітин і клітинних стінок за допомогою гомогенізаторів високого тиску, ультразвуку, хімічною обробкою (електроліти, поліелект-роліти, луги) і ферментаційні методи.

Біомасу грибків звичайно збирають прямим центрифугуван­ням культуральної рідини або сепаруванням.

Бактеріальні клітини вимагають попередньої обробки культу­ральної рідини шляхом флокуляції у крупніші коагулюючі скуп­чення для збільшення ефективності їх поділу в центрифузі.

При нейтральній реакції середовища бактеріальні клітини в культуральній рідині мають негативний заряд, обумовлений фос­фатними або карбоксильними групами клітинної стінки. Флоку-люючі агенти (амонію сульфат, кальцію хлорид) нейтралізують заряд і сприяють утворенню великих агрегатів клітин, які легко осідають із культуральної рідини.

Після попередньої обробки культуральну рідину центрифугу­ють або декантують.

Альтернативою центрифугуванню служить фільтрація. Для фільтрації невеликих об'ємів культуральної рідини використову­ють нутч- і друк-фільтри, вакуум-барабанні і ротаційно-вакуумні фільтри.

Прес-фільтри застосовують для обробки великих об'ємів рі­дини.

12.3.6.4. ВИДІЛЕННЯ ТА ОЧИЩЕННЯ ФЕРМЕНТУ
(IV СТАДІЯ)

Стадія виділення і хімічного очищення включає низ­ку процесів: від обробки нативного розчину до сушіння готового продукту.

Звичайно після центрифугування біомасу отримують у вигля­ді густої рідини або пасти із вологістю 70—85 %. Клітинну масу промивають, фільтрують, сушать, гідролізують, екстрагують із неї

необхідний фермент. Якщо ферменти знаходяться в розчині, біо­масу використовують після відділення як побічний продукт, а по­трібну речовину виділяють із розчину різними методами: осаджен­ням, фільтрацією, екстракцією тощо.

Для одержання високоочищеного ферменту застосовують ви­солювання, діаліз, електродіаліз, мембранну фільтрацію, гель-фільтрацію, іонообмінну хроматографію, афінну хроматографію, різні методи сорбції.

Концентрування розчинів, які містять ферменти, здійснюєть­ся ліофілізацією, вакуум-випарюванням, виморожуванням.

12.3.6.5. ОДЕРЖАННЯ ГОТОВОЇ ПРОДУКЦІЇ (V СТАДІЯ)

Після виділення і хімічного очищення ферменту його необхідно висушити — видалити з отриманого препарату вільну і зв'язану воду. Оскільки ферменти в основному термолабільні, для їх висушування необхідно застосовувати методи, які не призво­дять до втрати біологічної активності.

На сучасному етапі промислового одержання ферментів, вико­ристовують різні методи зневоднення препаратів. Широкого по­ширення набуло ліофільне сушіння ферментів, що здійснюється при порівняно низьких температурах (від -10 до -15 °С).

При роботі із значними об'ємами розчину, що містить фермен­ти, проводять висушування із застосуванням розпилювальних сушарок. Однією з важливих операцій хімічного очищення фер­ментів є кристалізація. Залежно від хімічної будови ферменту і його фізико-хімічних властивостей застосовують такі методи кри­сталізації: випарювання розчинника (ізотермічний), охолоджен­ня гарячого розчину (ізогідричний), одночасне охолодження і ви­парювання (комбінований), додавання в розчин інших речовин, які знижують розчинність (висолювання), виморожування.

Після висушування препарат, якщо він нестійкий, необхідно змішувати із стабілізатором або з наповнювачем (крохмалем, дек­стринами, неорганічними нейтральними сполуками, тальком тощо).

12.3.7. ІММОБІЛІЗАЦІЯ I СТАБІЛІЗАЦІЯ ФЕРМЕНТІВ

Іммобілізація ферментів — це підвищення їхньої ста­більності. Як відомо, у клітинах ферменти знаходяться частіше в «незв'язаній» формі, тобто прикріплені до певних структур і ло­калізовані в органелах. Тому ферменти характеризуються неста­більністю у разі дії низки фізичних і хімічних чинників і можуть інактивуватися. Це має місце і при одержанні ферментів мікро­біологічним шляхом, тому після досягнення у ферментаторі мак­симальної активності ферментів необхідно якнайшвидше провес-

ти їх виділення. Причиною зниження активності можуть бути протеази, які виділяються в середовище при автолізі клітин проду­цента або в мікроорганізми, що утилізують фермент.

При використанні ферментних препаратів для каталізу різних реакцій вільні ферменти досить чутливі до температури, pH сере­довища, наявності різних речовин. Дію цих чинників може дена­турувати білок. Крім того, вільні ферменти можуть бути викорис­тані лише одноразово, їхня вартість досить висока.

Досягнення молекулярної біології сприяли детальному вивчен­ню будови багатьох ферментів. Був розкритий амінокислотний склад багатьох ферментних білків, їх просторова конфігурація, виявлені активні центри, значення різних функціональних груп у виявленні каталітичної активності ферменту. Це дозволило ство­рити теоретичну базу для виробництва ферментів пролонгованої дії або, як їх називають, іммобілізованих, фіксованих, або зв'яза­них ферментних препаратів. Сутність іммобілізації ферментів — прикріплення їх в активній формі до нерозчинної основи, вклю­чення в гель або в напівпроникну мембранну систему.

Методи іммобілізації ферментів можна розділити на дві гру­пи: включення в гель мікрокапсули і зв'язування з носієм адсорб­ційним або ковалентним зв'язком. Найчастіше використовувані методи іммобілізації показані на рис. 12.8. Схеми б і д стосуються першого методу, інші — другого.

Допускається прикріплення ферментів тільки за допомогою функціональних груп, які не входять до активного центра і не бе­руть участь в утворенні фермент-субстратного комплексу. Носій ферменту, або матриця, може мати вигляд зернистого матеріалу, волокнистої структури, пластинчастої поверхні, плівок або тканин,

порожнистих волокон, трубочок, капсул тощо. Має значення роз­мір частинок носія, важливо, щоб він мав велику поверхню, тому рекомендується використовувати невеликі частинки діаметром 0,1—0,2 мм. Носій ферменту може бути як природною (нативною) речовиною, так і синтетичним полімером. Для іммобілізації широ­ко застосовують целюлозу і її похідні — кислу карбоксиметилце-люлозу і ацетилетилцелюлозу та ін. У воді целюлоза набухає, і її гідроксильні групи приєднують ділянки молекул ферменту. Із син­тетичних носіїв можна назвати карбоксильні або сульфоксильні хлориди у вигляді полімерних іонообмінних смол, діазотований поліаміностерин, нітратні кополімери кислоти метакрилової та ін.

Процес іммобілізації ферментів можна продемонструвати на прикладі зв'язування глюкоамілази з носієм ацетилетилцелюлози. Носій спочатку витримують протягом доби в очищеній воді для набухання. Потім при перемішуванні до ацетилетилцелюлози, що набухла, додають спочатку натрій-ацетатний буфер (pH = 5,53), потім — розчин очищеного ферменту. Після перемішування вно­сять поперечно-зшивальний агент — глутаровий альдегід, який утворює амідний зв'язок між аміногрупою носія і карбоксильною групою ферментного білка. Через кілька годин отриманий препа­рат промивають послідовно натрій-ацетатним буфером і розчином натрію хлориду для видалення сорбованого на носії білка. Іммобі­лізований у такий спосіб фермент зберігають під шаром води або буфера при температурі 3—5 °С.

Ферменти можна прикріплювати до поверхні носія шляхом сорбції до іонітів: до катіонів (які містять активні кислотні гру­пи) або до аніонітів (які містять переважно основні групи).

Як сорбенти — носії ферментів часто використовують гель алю­мінію гідроксиду або кальцію фосфату, діатоміт, модифікований крохмаль, бентоніти, кізельгур та ін. Сорбцію ферментів здійсню­ють або в колонках пропусканням розчину ферменту з певною швидкістю через шар іоніту, або в реакторах, в яких сорбент пев­ний час перемішують із розчином ферменту. Отриманий продукт потім використовують як іммобілізований ферментний препарат. Адсорбція ферменту на носії не забезпечує тривалої стабілізації. Більш тривалу стабілізацію забезпечує іонообмінне зв'язування ферменту, наприклад, на модифікованих іонообмінних целюлозах.

Широкого поширення набувають різні методи вміщення фер­ментів у гель. У процесі полімеризації гелю молекули ферменту зв'язуються на невеликих відстанях, і тоді фермент виявляється замкнутим усередині комірки гелю. Розміри пор гелю повинні бути менші за розміри молекул ферменту, але вони не повинні перешкоджати доступу субстрату до ферменту. Для іммобілізації ферменту з цілих клітин мікроорганізмів широко використову­ють поліакриламідний гель, кальцію альгінат, крохмаль та ін.

Нині розроблено методи іммобілізації багатьох ферментів. Де­які з них наведені нижче.

Як бачимо з цих прикладів, один і той же фермент можна іммобілізувати кількома методами. Так, лактатдегідрогеназу мож­на ввести в гель, прикріпивши до носія поперечним зшиванням; аспарагіназу — прикріпити до носія сорбційним шляхом або хіміч­ним (ковалентним) зв'язком і т. ін.

Нині налагоджено промисловий метод фізичної іммобілізації ферментів — включення ферменту у мікрокапсули і волокна. В обох методах фермент залишається у своєму звичайному водно­му оточенні, це забезпечує зберігання його активності і специфіч­ності. При мікрокапсулуванні крапельки водного розчину ферме­нту диспергують (розпиляють) в органічному розчиннику, і на межі поділу фаз виникає оболонка (мембрана) за рахунок міжфа-зної полімеризації або зниження розчинності близького за похо­дженням полімеру, який спочатку був присутній в одній із фаз. Як і в разі включення в гель, мембрана мікрокапсули проникна для низькомолекулярних субстратів, але непроникна для фермен­ту. Розміри капсул складають десятки або сотні мікрон, і вони легко відокремлюються від розчину фільтруванням.

Дуже поширений метод іммобілізації — включення ферменту у волокна. Спочатку одержують емульсію водного розчину фер­менту (або суспензію сухого ферменту) в органічному розчинни­ку, який містить полімер, здатний утворювати волокна. Найчас­тіше використовують триацетат целюлозу, а також нітроцелюлозу, етилцелюлозу тощо. Потім цю емульсію продавлюють через тонкі отвори в інший розчинник, який спричиняє коагуляцію поліме­ру. Утворюються волокна, які містять мікрокрапельки (близько 1 мікрона) водного розчину ферменту. Іммобілізація завжди по­в'язана із втратою частини активності ферменту, оскільки при зв'язуванні молекули ферменту з носієм може бути порушений вільний доступ субстрату до активного центра, або деякі реакцій-ноздатні групи активного центра використовуються для зв'язу­вання ферменту з носієм. Крім того, при іммобілізації у ферменту може змінитися конформація молекули з втратою активності або відбудеться часткова денатурація молекули.

Незважаючи на втрату від 10 до 90 % активності ферментів при іммобілізації, а також на деяке зменшення швидкості реакції

внаслідок утруднення дифузіїсубстрату, іммобілізовані ферменти мають значні технологічні переваги порівняно з незв'язаними.

Дуже важливо те, що іммобілізовані ферменти можна від­окремити від продуктів реакції і використовувати багаторазово та що фермент не забруднює продукт. При іммобілізації стає мож­ливим змінювати і цілеспрямовано модифікувати властивості фер­менту. I, нарешті, іммобілізовані ферменти звичайно більш ста­більні до дії температури і pH середовища.

12.3.8. ІНГІБІТОРИ ФЕРМЕНТІВ

Існують речовини різної хімічної природи, здатні гальмувати перебіг біохімічних реакцій, в яких фермент є каталі­затором. Гальмування може бути як оборотним, так і необерне-ним. Інгібітори відповідно поділяють на оборотні і необернені. При дії оборотних інгібіторів активність ферменту можна відно­вити видаленням інгібітору, наприклад, із використанням селек­тивних мембран або діалізу. При дії оборотних інгібіторів актив­ність ферменту не відновлюється.

Коли інгібітор за своєю структурою подібний до біоспецифічно-го субстрату конкретного ферменту, відбувається його приєднан­ня до активної ділянки каталізатора. Інгібітор заважає приєднан­ню субстрату, гальмування припиняється. При неконкурентному інгібуванні інгібітор приєднується не там, де зв'язується субстрат, і від внесення надлишку субстрату фермент не звільнюється. У разі неконкурентного інгібування фермент—фермент може одночасно зв'язуватися як з інгібітором, так і з субстратом. Існують інгібі­тори і змішаної дії, що залежить від структурних особливостей інгібітору і ферменту. Змішаний тип інгібування може виникати і в разі, коли інгібітор з'єднується не з вихідним фермент-суб-стратним комплексом, а з проміжними продуктами, що утворю­ються в процесі реакції.

Інгібіторами ферментів є солі важких металів, речовини, які специфічно впливають на сульфгідрильні угруповання фермент­ного білка (органічні сполуки меркурію, арсен), специфічні білки рослин, мікроорганізмів і тварин, полісахариди, антибіотики, та­ніни та ін.

і курильні (інгаляційні) збори. Збори для внутрішнього застосу­вання бувають в'яжучі, жовчогінні, потогінні, гіркі (апетитні), грудні, заспокійливі, проносні, вітрогінні, вітамінні і т. ін. Збори для зовнішнього застосування поділяють на збори для полоскань, для припарок або пом'якшувальні, для ванн тощо. Курильні збо-ри використовуються для безпосереднього введення диму, який містить леткі діючі речовини, в легені.

Збори (Species) — це суміші різаної або грубоздрібне-ної рослинної лікарської сировини (крім рослин, що містять силь­нодіючі речовини), до яких іноді додають солі, ефірні масла або інші речовини. У перекладі з латинського слово «збір» означає «рід», «вид» (певний вид або суміш різних видів лікарських рос­лин).

Людина ще з глибокої давнини мала значний запас відомостей про лікарські властивості різних рослин і широко застосовувала їх. Збори зберегли своє значення дотепер завдяки наявності в ро­слинній сировині діючих речовин в нативному вигляді, простоті приготування і застосування, доступності сировини.

Вадами зборів є: незавершеність лікарської форми (хворий має приготувати чай, полоскання і т. ін.) і неточність дозування (для недозованих зборів).

При заводському виробництві є можливість подальшого удо­сконалення цієї лікарської форми: поліпшення якості подрібнен­ня та однорідності змішування; усунення основної вади зборів — неточності дозування при застосуванні.

Дата добавления: 2016-03-26 | Просмотры: 701 | Нарушение авторских прав