АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Культивування мікроорганізмів

Вимоги до живильних середовищ. Для вирощування бактерій у лаборатор-них умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стан-дартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяльності мікроорганізмів.

У першу чергу, бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту висту-пають численні речовини, в основному, тваринного походження (м’ясо яловиче, риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використовувати й замінники м’яса – плаценту, кров’яні згустки, дріжджі. Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і вода, а також ростові фактори (вітаміни групи В, ферменти). Універсальним дже-релом їх служать екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу се-редовищ включають нативні субстрати – кров, сироватку, асцитичну рідину, яєч-ний жовток, шматочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію, мати у своєму складі неорганічні фосфати.

Допускається застосування речовин, які усувають дію інгібіторів росту і ток-синоутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності та рівень окисно-відновного потенціалу (Еh), який для аеробних мікроорганізмів досягає понад 0,08 В, а для анеробних бактерій коливається в межах 0,12-0,60 В.

Середовища повинні мати певну в’язкість, густину, мати певну вологість (до 20 % води), бути ізотонічними, прозорими й обов’язково стерильними.

Основні живильні середовища. Численні потреби мікроорганізмів зумовлю-ють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існу-ють спеціальні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо

Частина І. Загальна мікробіологія

перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові середовища за-водського виготовлення (сухі), які здатні задовольнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використову-ють згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища ство-рюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів. Їх використовують в основному для експеримен-тального вивчення окремих ланок метаболізму бактерій.

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал, який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропеп-тин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бак-терій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіо-логічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також же-латин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Залежно від потреб бактеріологів живильні середовища поділяються на п’ять основних груп.

Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать м’ясо-пеп-тонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наяв-ністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випад-ках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, си-роватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон, асцит-агар та інші.

Третя група – елективні середовища, на яких мікроорганізми певного виду ростуть швидше, більш інтенсивно, опереджають у своєму розвитку інші види бактерій. Наприклад, 1 % лужна пептонна вода є елективним середовищем для холерних вібріонів, середовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії.

Четверта група селективні середовища, які завдяки додаванню певних ком-понентів (жовч, фарби, антибіотики та ін.) здатні пригнічувати розвиток одних видів мікроорганізмів, але не впливають на інші види. Так, середовище Мюллера є селективним для тифо-паратифозних бактерій, фуразолідоно-твіновий агар – для коринебактерій і мікрококів. Додавання антибіотиків до складу середовищ ро-бить їх селективними для грибів (напр. середовище Сабуро та ін.).

П’ята група – диференціально–діагностичні середовища. Це велика група се-редовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, ре-дукуючих властивостей (середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, Гісса).

Все ширше застосування в мікробіологічних лабораторіях знаходять численні комерційні тест-системи для біохімічної ідентифікації мікроорганізмів, виготов-

Розділ 4. Фізіологія бактерій

лені на основі різноманітних диференційно-діагностичних середовищ. В одному варіанті виконання вони вносяться в спеціальні полістиролові або інші планшети та висушуються для видалення води. До них належать системи АРІ-20 для іденти-фікації стафілококів, коринебактерій, ентеробактерій, анаеробних мікробів, Enterotest 1 і 2, російська система ПБД (пластина біохімічна диференційна) для ідентифікації ентеробактерій (див.вкл., рис. 29). Непогано зарекомендували себе тест-системи Roche та інші.

Інші варіанти подібних тест-систем передбачають адсорбцію диференціюю-чих субстратів на паперових або полімерних носіях. Серед них розповсюджені системи Auxtab, Minitek, Morlok, Micro-ID.

Подібні системи зручні в користуванні, вони дозволяють одночасно досліди-ти широкий спектр мікробних ознак, завжди готові до використання в будь-яких мікробіологічних лабораторіях, вони прості й надійні, вимагають невеликих об’ємів посівного матеріалу, тому економлять лабораторний посуд, піпетки. Ко м п ’ютерна обробка одержаних результатів дає змогу швидко визначити й оці-нити вид невідомого збудника.

Виготовлення живильних середовищ. До складу будь-яких середовищ вхо-дять переважно натуральні тваринні або рослинні продукти і компоненти – м’ясо, рибна мука, яйця, молоко, кров, дріжджовий екстракт, картопля тощо. З них готу-ють спеціальні напівфабрикати у вигляді екстрактів, настоїв, ферментативних і кислотних гідролізатів (м’ясна вода, дріжджовий екстракт, триптичний гідролізат Хоттінгера, пептон та інші), які є основою для подальшого конструювання жи-вильних середовищ. Крім цього, в живильні середовища додають різні неорганічні солі залежно від потреб мікробної клітини. Як прaвило, концентрація хлориду натрію складає 5,0 г/л, KH₂PO₄ – 0,2-0,5 г/л, MgSO₄·7H₂O, інші солі додаються із розрахунку 0,001 г/л. У необхідних випадках до складу вводять вуглеводи (цукри, багатоатомні спирти), амінокислоти в концентрації 0,5-1,0 %, а також вітаміни (до 0,001 мг/мл).

Для забезпечення необхідної густини середовища використовують агар-агар, який одержують з морських водоростей. Він є зручним і необхідним компонентом середовищ, оскільки не споживається бактеріями як ростовий субстрат. Утворю-ючи у воді гель, він плавиться при температурі біля 100 °С, а густіє при 40 °С. Джерелом желатину є багаті на колаген субстрати. Серед них хрящі, сухожилки, кістки тощо. Гель, який отримують внаслідок використання желатину, плавиться при температурі біля 32-34 °С і гусне при 28 °С. Проте численні мікроорганізми здатні розщеплювати желатин, тому використання останнього як наповнювача середовища вважається недоцільним. Найчастіше такі середовища з желатином застосовуються для визначення протеолітичних властивостей бактерій.

Виготовлення живильних середовищ є складним динамічним процесом, який потребує уваги бактеріолога. Цей процес складається з декількох основних етапів. Спочатку до дистильованої води згідно з прописом додають необхідні сухі компо-ненти середовища, ретельно перемішують, розчиняючи при нагріванні. Обов’яз-ков о встановлюють рН середовища, яке визначають або за допомогою іонометра,

Частина І. Загальна мікробіологія

або індикаторними папірцями. При цьому слід звернути увагу, що після стерилі-зації реакція середовища падає на 0,2. Середовища, які містять агар, фільтрують через ватно-марлевий фільтр у гарячому стані, рідкі середовища – через паперові фільтри. Якщо є необхідність, їх освітляють осадженням або за допомогою білка курячого яйця чи сироватки. Середовища розливають у спеціальні матраци, кол-би, флакони і закривають ватно-марлевими пробками з паперовими ковпачками. Залежно від складу середовища використовують різні режими стерилізації. Так, середовища, які містять вуглеводи, желатин стерилізують в автоклаві 15 хв при температур і 11 2 °С або текучою парою при температурі 100 °С дробно. Сер едови-ща без ву гл е в о д і в можна стерилізувати в автоклаві при 115-120 °С протягом 20 хв. Якщо до складу середовищ входять нестійкі до температури компоненти, такі, як нативний білок, сироватка, сечовина, то вони стерилізуються або фільтруванням через бактеріальні фільтри, або їх додають готовим у стерильне середовище. Кон-троль стерильності середовищ здійснюють шляхом витримування їх у термостаті протягом декількох діб при температурі 37 °С.

Наводимо приклади виготовлення деяких простих живильних середовищ, які найчастіше використовуються в мікробіологічній практиці і можуть бути осно-вою для виготовлення більш складних.

М’ясна вода. Для її виготовлення використовують свіжу яловичину, яку по-передньо очищають від жиру, фасцій, сухожилків тощо, розрізають на дрібні шмат-ки і пропускають через м’ясорубку. Отриманий фарш заливають водопровідною водою в співвідношенні 1:2, розмішують і на добу залишають у прохолодному місці. Отриманий настій кип’ятять протягом 30-60 хв, періодично знімаючи на-кип, а потім відстоюють. Відділяють рідину від фаршу, фільтрують через фільтру-вальний папір або полотно і доливають водопровідною водою до первинного об’єму, потім розливають у флакони і стерилізують при 1 атмосфері (температура 120 °С) протягом 30 хв. Стерильна м’ясна вода прозора, має жовтуватий колір, а на стінках флакона і на дні утворюється осад із білків, які згорнулись. То м у при подальшому використанні середовища його знову фільтрують. Активна реакція середовища – 6,2.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Щоб виготовити МПБ, до м’ясної води додають 1 % пептону і 0,5 % хлориду натрію, встановлюють необхідне рН за до-п омогою 20 % розчину NaOH і кип’ятять 30-40 хв, постійно перемішуючи. Бульйон фільтрують через паперовий або полотняний фільтри, розливають у флакони, про-бірки, перевіряють активну реакцію середовища і стерилізують при 120 °С про-тягом 20 хв.

М’ясо-пептонний агар (МПА). До м’ясо-пептонного бульйону додають дрібно нарізаний агар-агар (2-2,5 %). Одержану суміш кип’ятять до розчинення агар-агару, фільтрують, встановлюють рН і розливають у флакони. Стерилізацію проводять протягом 20 хв при температурі 120 °С.

Середовища з кров’ю, сироваткою або асцитичною рідиною. Оскільки ці середовища не можуть довго зберігатись, їх готують безпосередньо перед засто-суванням. Для цього до розтопленого і охолодженого до 45-50 °С МПА додають

Розділ 4. Фізіологія бактерій

стерильно 5-10 % свіжої або дефібринованої крові барана, кролика або іншої тва-рини. Флакони з агаром ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі, слідку-ючи за відсутністю піни.

Ідентично готують сироватковий (5-10 % сироватки крові) або асцитичний агар (25 % асцитичної рідини).

Триптичний перевар за Хоттінгером. Бульйон із нього економічніший за інші м’ясо-пептонні середовища, оскільки дозволяє з однієї порції м’яса одержа-ти в декілька разів більше бульйону. У цьому середовищі міститься велика кількість амінокислот, отже, підвищується його буферність, і за рахунок цього більш стаб-ільним є значення активної реакції середовища.

Для виготовлення перевару беруть один кілограм м’яса без сухожилків і жиру, порізаний на дрібні шматки розміром до 1-2 см, занурюють у каструлю з подвійним об’ємом води, яка кипить, і кип’ятять 15-20 хв, поки м’ясо не стане сірим, що свідчить про коагуляцію білків. Його виймають з рідини і пропускають через м’ясорубку. У рідині, яка залишилась, встановлюють рН 8,0, опускають туди фарш і охолоджують до 40 °С. Потім додають 10 % (до об’єму рідини) свіжої підшлункової залози, попе-редньо очищеної від сполучної тканини, жиру і двічі пропускають через м’ясорубку. Замість залози використовують сухий препарат панкреатину (0,5 %). Одержану с у м і ш ретельно збовтують і доводять рН до 7,8-8,0. Через 30 хв перевіряють рН. Якщо активна реакція середовища не змінюється в кислу сторону, це свідчить про недо-броякісність ферменту. Ко л и рН середовища стабілізується, суміш переливають у великі бутлі, заповнюючи їх на 1/3. Додають до 3 % хлороформу, закривають посуд резиновими корками та інтенсивно збовтують для перемішування рідин. Надлишок парів хлороформу випускають. Через 1-2 год знову перевіряють рН середовища, встановлюючи його на 7,4-7,6. Отриману суміш залишають при кімнатній температу-рі на строк до 16 днів. Протягом перших 3-4 днів щоденно перевіряють і коригують рН середовища, а також збовтують флакони не менше, ніж 3 рази на добу. Пізніше цю процедуру можна не проводити і збовтувати середовище слід не так часто. За 1-2 дні до закінчення циклу перетравлювання збовтування середовища припиняють.

Про завершене якісне переварювання свідчать просвітління рідини, яка на-буває солом’яно-жовтого кольору, а також утворення на дні пилоподібного осаду. Рідина легко фільтрується, її перевіряють на наявність триптофану за допомогою проби з бромною водою (до 3-4 мл фільтрату додають 3-4 краплі бромної вод и). За наявності триптофану (до 2,0-3,0 г/л) колір середовища змінюється на рожево-фіолетовий. Визначають загальний азот, який в нормі досягає 11,0-12,0 г/л, і амін-ний азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гідролізат фільтрують через паперовий або полотняний фільтр, розливають у бутлі та автоклавують при 120 °С протягом 30 хв. У такому вигляді він може зберігатись тривалий час.

Його використовують для отримання бульйону Хоттінгера. З цією метою до 100-200 мл гідролізату додають 800-900 мл дистильованої води, 0,5 % хлориду натрію та 0,2 % однозаміщеного фосфорнокислого натрію. Доводять рН до 7,4-7,6, розливають у флакони і стерилізують 20 хв при 120 °С.

Частина І. Загальна мікробіологія

М’ясо-пептонний агар на основі гідролізату Хоттінгера готують за рецепту-рою звичайного МПА.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватися стандартни-ми сухими живильними середовищами, які випускає бактеріологічна промис-ловість. Такі середовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіолог-ічних досліджень і стандартизувати їх.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1899 | Нарушение авторских прав