АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів

Мікроорганізми і віруси дуже малі за своїми розмірами, тому побачити їх неозброєним оком неможливо. У той же час морфологія мікробів, їх розміри, фор-ма, взаємне розташування клітин, наявність чи відсутність джгутиків, внутрішня ультраструктура є дуже важливою їх характеристикою і часто служить основою класифікації. Зважаючи на це, одним з найважливіших методів дослідження будо-ви мікроорганізмів є мікроскопія. В основі сучасних мікроскопічних методів до-слідження лежить світлова мікроскопія з численними її різновидами, такими як темнопольна, фазово-контрастна, аноптральна, поляризаційна, інтерференційна, люмінесцентна та ін. При вивченні анатомії й ультраструктури вірусів використо-вують електронну мікроскопію.

Сучасна промисловість випускає багато видів мікроскопів залежно від їх при-значення. У практичній роботі рутинних баклабораторій найчастіше користують-ся мікроскопами МБР-1, МБР-3 (рис. 1).

Мікроскоп складається з механічної, оптичної й освітлювальної частин. До ме-ханічної входять штатив, тубус, револьвер, предметний столик, макро- й мікрогвинт, до оптичної – об’єктиви й окуляри, до освітлювальної – дзеркало й конденсор.

Частина І. Загальна мікробіологія

У верхній частині штатива є тубус, в який вставляється оку-ляр, а знизу він має револьвер, в отвори якого вгвинчені 3-4 об’єк-тиви. Обертаючи револьвер, можна встановити будь-який об’єктив під отвір тубуса. Остан-ній підіймається і опускається за допомогою макро- й мікромет-ричного гвинтів. Для грубого на-ведення зображення користують-ся макрогвинтом. Більш точно це робиться за допомогою мікро-гвинта. Мікрометричний гвинт є однією з найбільш тендітних ча-стин мікроскопа й вимагає обе-режного поводження з ним. Предметний столик має круглу або прямокутну форму. В його центрі знахо-диться отвір, над яким розміщують предметне скло з препаратом (мазком). У більш досконалих мікроскопах є дуже зручні предметні столики, які за допомогою спеці-альних пристроїв переміщують предметне скло у двох взаємно перпендикуляр-них напрямах.

Найціннішою частиною мікроскопа є об’єктиви, які складаються з кількох лінз у загальній металевій оправі. Об’єктиви поділяються на сухі (×8, ×40) та імерсійні (×90, ×120). Сухими називають такі об’єктиви, між фронтальною лінзою яких і предметним склом знаходиться повітря. При цьому, у зв’язку з різницею показників заломлення скла й повітря (відповідно 1,52 і 1,0), частина світлових променів не потрапляє в око мікроскопіста. Імерсійними називають такі об’єкти-ви, між фронтальною лінзою яких і досліджуваним об’єктом знаходиться кедро-ва, персикова олія чи “імерсіол”, коефіцієнт заломлення світла яких такий самий, як і в скла. При дослідженні морфології мікроорганізмів користуються переваж-но імерсійними об’єктивами, які часто називають імерсійною системою.

Найважливішою характеристикою будь-якого об’єктива є його роздільна здатність. Це та найменша відстань між двома точками, при якій вони ще видимі роздільно, тобто не зливаються в одну. Роздільна здатність об’єктива обмежена такими явищами, як хроматична й сферична аберації, дифракція та ін. Якщо обидва види аберації можна усунути, то явище дифракції існує в будь-якій оптичній сис-темі і його усунути або принаймі зменшити практично неможливо. Дифракція в значній мірі обмежує роздільну здатність мікроскопів. Цю величину можна вира-хувати за формулою:

A = 0,61

X

n ⋅sin α

,

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

де А - роздільна здатність; 0,61 - коефіцієнт геометричних величин при ви­рахуванні освітленості першого дифракційного максимуму; X - довжина світло­вої хвилі; n - sina - постійна величина для кожного об’єктива, яка називається чис­ловою або нумеричною апертурою. У сучасних сухих об’єктивах вона не пере­більшує 0,95, а в імерсійних - від 1,25 до 1,60. Нумеричні апертури вигравірувані на оправі кожного об’єктива. Роздільна здатність об’єктивів прямопропорційна їх нумеричній апертурі й обернено пропорційна довжині хвилі світла.

При мікроскопії у видимому світлі з довжиною хвилі 0,55 мкм та імерсійним об’єктивом з максимальною числовою апертурою 1,60 роздільна здатність дорівнює:

A = 0,61 0,55 = 0,2мкм

Отже, при користуванні навіть найкращими імерсійними об’єктивами немож­ливо побачити об’єкти, які мають розміри менші за 0,2 мкм. Корисне збільшення об’єктива не може перевищувати нумеричну апертуру більше, ніж у 1000 разів. Таким чином, максимальне корисне збільшення сучасних мікроскопів при вико­ристанні імерсійних об’єктивів з апертурою 1,40-1,60 досягає 1400-1600.

Окуляр складається з двох лінз і тільки збільшує зображення, яке виходить від об’єктива, не додаючи до нього будь-яких деталей. Існують окуляри з такими збільшеннями: х7, Х10, Х15. Ці цифри позначені на них.

Освітлювальний апарат знаходиться під предметним столиком і складається із дзеркала та конденсора з діафрагмою. Дзеркало спрямовує пучок світла в кон­денсор, а через нього - в об’єктив мікроскопа. Один бік дзеркала увігнутий, дру­гий - плоский. При мікроскопуванні з конденсором необхідно користуватись лише плоским дзеркалом. Конденсор Аббе складається з системи лінз для збирання пучка променів в одній точці (фокус), яка знаходиться в площині досліджуваного препа­рату. При роботі з денним освітленням конденсор потрібно підіймати до рівня предметного столика, з штучним - опускати доти, поки зображення джерела світла не з’явиться в площині препарату. При дослідженні незабарвлених препаратів конденсор також опускають.

Об’єм світла відповідно до потреб дослідження регулюється діафрагмою, яка знаходиться під конденсором. Вона може звужуватись і розширюватись подібно до зіниці ока (звідси назва іріс-діафрагма). Забарвлені препарати розглядають при відкритій, а незабарвлені - при звуженій діафрагмі.

Сучасні мікроскопи мають ряд удосконалень, завдяки яким покращується зображення та розширюються межі видимості. Перше досягнуто випуском мікро-скопів-бінокулярів, друге - дослідженням у темному полі зору. Бінокулярний мікроскоп має спеціальну насадку з двома тубусами (бінокулярна насадка). Це створює ряд переваг при мікроскопуванні. Досліджуваний препарат розглядають відразу обома очима, що не викликає перевтоми органа зору. При цьому одночас­но досягається більша чіткість глибини зображення і його пластичність.

З метою фундаментальних досліджень морфології мікроорганізмів та інших клітин оптична промисловість випускає більш досконалі мікроскопи. Одним із них

Частина І. Загальна мікробіологія

є мікроскоп універсальний біологічний дослідницький МБД-15. За його допомогою можна проводити широкий об’єм мікроскопічних досліджень: візуальне спостере-ження, використання світлого і темного полів зору в прямому, косому та відбитому світлі, метод фазових контрастів, люмінесцентну та інтерференційну мікроскопію. Для мікрофотографування досліджуваних об’єктів мікроскоп оснащений фотоапа-ратом з автоматичним затвором, фотоекспонометром та імпульсною лампою.

При вивченні динаміки розвитку і розмноження мікроорганізмів, дії на них різних фізичних і хімічних факторів, утворення L-форм та інших проблем виго-товляють спеціальні мікроскопи з мікроустановками для цейтраферної (перерив-частої) мікрокінозйомки, особливо з використанням методу фазових контрастів.

Правила роботи з імерсійною системою:

1. Підняти конденсор Аббе до рівня предметного столика, повністю відкрити іріс-діафрагму.

2. Користуючись об’єктивом 8, за допомогою плоского дзеркала домогтися максимального освітлення поля зору.

3. На предметному столику розмістити забарвлений препарат-мазок, нанести на нього кедрову олію і закріпити клемами.

4. Повертаючи револьвер, встановити над препаратом імерсійний об’єктив 90, під контролем зору занурити його в краплю кедрової олії.

5. Дивлячись в окуляр лівим оком (не закриваючи правого), спочатку за допо-могою макрогвинта знайти контури зображення, потім, користуючись мікрогвин-том, досягти максимальної чіткості, вивчити і замалювати препарат.

6. Після закінчення роботи підняти тубус, зняти предметне скло, обережно витерти імерсійний об’єктив від кедрової олії, повернути його вбік, опустити тубус.

Освітлення за методом Келлера. Найкращі результати мікроскопії при суб’єк-тивних дослідженнях і мікрофотографуванні можна отримати лише при умові чіткого центрування всіх оптичних частин мікроскопа, включаючи і систему ос-вітлення. Цього досягають при використанні методу Келлера.

1. Фабричний освітлювач з “точковим” джерелом світла встановлюють на віддалі 25-30 см від мікроскопа так, щоб плоске дзеркало відкидало світлову пля-му діаметром біля 8 мм на закриту діафрагму конденсора. За цим процесом слідку-ють за допомогою дзеркальця, покладеного на праву ніжку мікроскопа.

2. На предметний столик вміщують препарат, користуючись сухими об’єкти-вами (×8, ×40), наводять чітке зображення, знімають окуляр і на верхній кінець тубусу кладуть матове скельце. На ньому видно зображення об’єкта в центрі світло-вої плями. При необхідності установку коригують. Відкривають до оптимального діаметра отвір діафрагми конденсора.

3. Встановлюють необхідний об’єктив і окуляр (краще ×10) і приступають до вивчення або фотографування досліджуваного об’єкта.

Препарати-мазки слід виготовляти на предметних скельцях товщиною не більше 1,1-1,4 мм.

Темнопольна мікроскопія відрізняється від звичайної імерсійної світлової способом освітлення препарату. У звичайному мікроскопі об’єкт досліджують при

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

світлі, яке проходить, у темнопольному – при боковому освітленні. Для мікроско-пії в темному полі використовують замість конденсора Аб б е спеціальний парабо-лоїд-конденсор (кардіоїд-конденсор), в якому бокова поверхня дзеркальна, а цент-ральна частина нижньої лінзи затемнена, в результаті чого утворюється темне поле зору. Яскраві бокові промені, відбиваючись від дзеркальної поверхні, фокусуються в площині об’єкта, але в очі мікроскопіста не потрапляють. В об’єктив проникають лише ті промені, які відбиваються частинками препарату завдяки заломленню або дифракції. Отже, на темному полі зору мікробні клітини й інші дрібні частинки виглядають дуже яскравими. Картина нагадує миготливі зірки на темному небі.

Темнопольний мікроскоп дає змогу розглядати об’єкти розміром 0,02-0,04 мкм, тобто значно менші, ніж під звичайним світловим мікроскопом. То м у темнопольний мікроскоп часто називають ультрамікроскопом. Мікроскопію в тем-ному полі зору використовують для дослідження рухливості бактерій, виявлення збудників сифілісу, лептоспірозу, поворотного тифу. Але при цьому не можна доб-ре вивчити внутрішню структуру мікроорганізмів. Для цієї мети запропоновані видозмінені методи оптичної мікроскопії: фазово-контрастна, аноптральна та лю-мінесцентна.

Фазово-контрастна мікроскопія – спосіб мікроскопічного дослідження про-зорих, не поглинаючих світла об’єктів, який базується на підсиленні контрасту зображення. Він полягає в тому, що живі клітини (бактерії), слабо поглинаючи світло, все ж таки здатні змінювати фазу проникних променів. У різних ділянках клітини товщина, щільність, а, отже, й показники заломлення світла будуть неод-накові. Ці різниці у фазах ні орган зору, ні фотоплівка не помічають. Але їх можна зробити видимими за допомогою спеціально-го фазово-контрастного пристрою (рис. 2). Він включає в себе конденсор з набором кільце-вих діафрагм, які забезпечують освітлення препарату повним конусом світла, та фазово-контрастні об’єктиви. Вони відрізняються від звичайних об’єктивів тим, що в їх головному фокусі розташовується напівпрозора фазова пластинка у вигляді кільця. Саме вона викли-кає здвиг фази світла, що проходить через неї. Це дозволяє зробити незабарвлені препарати чітко видимими.

При роботі з фазово-контрастним при-стрієм клітини можуть виглядати темними (по-зитивний фазовий контраст) або світлими (не-гативний контраст) у порівнянні з оточуючим фоном. Цей вид мікроскопії не збільшує роз-дільної здатності, але дозволяє виявити нові деталі внутрішньої структури живих бактерій,

Частина І. Загальна мікробіологія

тиків та інших хіміопрепаратів. Він має й деякі недоліки: слабка контрастність зображень, наявність сяючих ореолів навколо досліджуваних об’єктів. Значні пе-реваги перед фазово-контрастним пристрієм має аноптральний мікроскоп.

Аноптральна мікроскопія – різновид фазово-контрастної, при якій викори-стовують об’єктиви зі спеціальними пластинками, нанесеними на одну з лінз у вигляді затемненого кільця кіптяви або міді. Це обумовлює поглинання близько 10 % світла, яке проходить через об’єктив і робить фон поля зору сіро-коричне-вим. Широкий центральний отвір в шарові кіптяви чи міді випускає з об’єктиву основну частину дифрагованого світла, у той час як темний шар кільця затримує небажане периферійне дифраговане світло. За рахунок цього в значній мірі усу-вається ореол навколо досліджуваних клітин.

Аноптральна мікроскопія успішно використовується при вивченні таких ма-локонтрастних живих об’єктів як бактерії, гриби, найпростіші і навіть деякі віру-си. При цьому досягається більша контрастність, роздільна здатність, стерео-скопічність і чіткість зображення. Досліджувані мікроорганізми при цьому набу-вають різних відтінків: від білого до золотаво-коричневого.

Інтерференційна мікроскопія базується приблизно на тих же принципах, що й фазово-контрастна. Але на відміну від останньої вона дає можливість вивча-ти деталі прозорих об’єктів і проводити їх кількісний аналіз. Це досягається зав-дяки роздвоєнню світлового променя: один промінь проходить через частинку об’єкта, а другий – поза нею. В окулярі обидва промені з’єднуються та інтерферу-ють між собою. Різницю виникаючих фаз можна виміряти, визначаючи тим са-мим масу різних структур у клітині. Так визначають товщину об’єкта, концентра-цію в ньому сухої речовини, вміст води, що дає змогу зробити побічні висновки про проникність мембран, активність ферментів, метаболізм клітин.

Інтерференційну мікроскопію використовують у цитологічних дослідженнях, при кількісному аналізі клітинних структур живих об’єктів, наприклад, найпрос-тіших, культур тканин тощо.

Люмінесцентна мікроскопія останнім часом широко використовується в мікробіологічних дослідженнях. Цей метод дозволяє спостерігати первинну або вторинну люмінесценцію (світіння) мікроорганізмів, клітин, тканин та окремих їх структур. Зображення в люмінесцентному мікроскопі настає через світіння са-мого препарату, яке виникає при освітленні його короткохвильовими променями. Метод побудований на використанні явища флуоресценції. Оскільки більшість хвороботворних мікробів не мають первинної (власної) люмінесценції, їх спочат-ку обробляють слабкими розчинами спеціальних барвників (флуорохромів), які зв’язуються певними структурами живих бактерій, не завдаючи їм шкоди. Найча-стіше застосовують такі флуорохроми: акридиновий оранжевий, аурамін, кори-фосфін, ізотіоціанат флуоресцеїну, трипафлавін та ін.

Промені світла від сильного джерела, наприклад, ртутної лампи надмірного тиску, пропускають через синьо-фіолетовий світлофільтр. Під дією такого опромі-нення забарвлені флуорохромом бактерії починають світитися червоним, зеленим, жовтим або іншим світлом. Так, при забарвленні дифтерійних паличок корифос-

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень

фіном вони набувають жовто-зеленого світіння, а при обробці аурамін-родаміном збудник туберкульозу світиться золотаво-оранжевим кольором.

Метод люмінесцентної мікроскопії набагато чутливіший порівняно з іншими мікроскопічними дослідженнями. Він дозволяє виявити таку малу кількість збуд-ника, яку іншими методами не знаходять. За характером люмінесценції диферен-ціюють окремі хімічні речовини, що входять до складу мікробних клітин. Вико-ристання люмінесцентного мікроскопа має ряд переваг: кольорове зображення, висока контрастність, можливість досліджувати як живі, так і вбиті мікроорганізми.

Люмінесцентну мікроскопію широко застосовують для виявлення антигенів і антитіл (метод імунофлуоресценції). За її допомогою можна побачити мікроби, які містять певні антигени. Для їх виявлення необхідно мати специфічні люмінес-центні сироватки, які викликають флуоресценцію саме даного антигена. Цей ме-тод успішно використовують для експрес-діагностики багатьох бактерійних і вірус-них захворювань.

Окрім люмінесцентного пристрою ОІ-17 та спеціальних освітлювачів ОІ-18, ОІ-28, ОСЛ-1, бактеріологічні лабораторії оснащені люмінесцентними мікроско-пами МЛ-2, МЛД-1 та ін. Модель МЛ-2 має великий комплект оптики, фільтрів, фотонасадку, дає змогу проводити одночасно комбіновані спостереження: люміне-сцентне – при освітленні препарату зверху і фазово-контрастне – в проникному світлі (рис. 3).

Електронна мікроскопія. Для вивчення будови мікроорганізмів на субклітин-ному і молекулярному рівнях, а також для дослідження структури і архітектоніки вірусів використовують електронний мікроскоп. Це високовольтний вакуумний прилад, у якому збільшене зображення отримують за допомогою потоку елект-ронів. Він має високу роздільну здатність і може давати збільшення від 20 тис. до 5 млн разів. За принципом дії розрізняють просвічуючі (трансмісивні), скануючі (растрові) й комбіновані електронні мікроскопи.

Принципова схема просвічуючого елект-ронного мікроскопа мало чим відрізняється від звичайного оптичного. Можливості світлово-го мікроскопа обмежені не якістю лінз, а вели-ко ю довжиною світлових хвиль (0,29-0,8 мкм). Мала довжина хвилі електронів (0,0002 мкм і навіть менше) дозволяє значно збільшити роз-дільну здатність електронного мікроскопа. Замість світла в ньому використовують потік електронів, джерелом яких є вольфрамова нит-ка, що нагрівається електричним струмом (електронна пушка). Роль лінз оптичного мікроскопа виконує кругове електромагнітне поле. Пучки електронів, проходячи через дос-ліджуваний об’єкт, відхиляються під різними кутами залежно від неоднакової товщини та _{Рис.3. Люмінесцентний мікроскоп.}

Частина І. Загальна мікробіологія

щільності різних ділянок препарату і потрапляють в об’єктивну лінзу. В ній появ-ляється перше корисне збільшення об’єкта.

Після об’єктивної лінзи електрони потрапляють у проміжну лінзу, яка слу-жить для плавного збільшення зображення. Проекційна лінза створює кінцеве збільшене зображення об’єкта, яке направляється на флуоресціюючий екран. Зав-дяки взаємодії швидких електронів з люмінофором екрану виникає видиме зобра-ження об’єктів. Після наведення чіткості проводять фотографування.

Електронна мікроскопія вимагає спеціальної підготовки об’єктів досліджен-ня. Необхідна спеціальна фіксація тканин або бактерій, їх ретельне зневоднення, заливка в епоксидні смоли, виготовлення ультратонких зрізів. Для підвищення чіткості зображення використовують методи позитивного й негативного контрас-тування та відтінення.

Досліджуваний об’єкт спочатку зафіксовують особливими фіксаторами, потім наносять на надзвичайно тонку колодієву або целюлозну плівку, вміщену на спеці-альну сіточку-підкладку. При напиленні на поверхню препарату під певним кутом у вакуумі наносять тонким шаром важкі метали, хром, золото, паладій. Розпоро-шені частинки металу осідають на піднесених чи заглиблених ділянках бактерій або вірусів. При дослідженні таких препаратів деталі їх структури проявляються рельєфно й контрастно (позитивне контрастування). Негативне контрастування зводиться до нанесення на препарат розчинів з атомами важких металів, наприк-лад, фосфорно-вольфрамової кислоти. Осідаючи навколо білкових частинок дос-

ліджуваного об’єкта й заповнюючи всі проміжки між ними, атоми важких металів “забарвлюють” фон, на якому виступають найменші деталі бу-дови мікроорганізмів.

Широко також використовують ультратонкі зрізи клітин, бактерій, що дає змогу вивчити їх структуру на субклітинному й молекулярному рівнях.

Сучасна українська й зарубіжна промис-ловість випускає багато моделей електронних мікроскопів (рис. 4), які мають величезні мож-ливості для вивчення мікроскопічного світу.

Методи електронної мікроскопії привели до великих успіхів у розвитку таких наук як цито-логія, бактеріологія, генетика і, особливо, віру-сологія. Успішно розвивається імунна електрон-на мікроскопія, яка дає змогу визначити родову належність вірусів, що використовується для експрес-діагностики багатьох вірусних інфекцій.

Бактеріологічний, серологічний, біологічний та алергічний методи діагнос-тики інфекційних хвороб детально викладені в наступних розділах.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

Розділ 3

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 2793 | Нарушение авторских прав