АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ

Генетика бактерій та вірусів – наука, що вивчає механізми успадковування генетичних ознак та їх фенотипові прояви. Генетичний апарат прокаріотів побу-дований із двоспіральної суперспіралізованої ДНК. Сукупність генів нуклеоїду і позахромосомних факторів зумовлює генотип бактерій, а фенотип – це індивіду-альний вияв генотипу в конкретних умовах існування.

Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову, або модифі-каційну та спадкову, або генотипову. Неспадкова мінливість виникає під впливом ф акторів зовнішнього сер едовища (зміна морфології клітини, поя ва L- форм тощо). Модифікаційні зміни нетривалі, після припинення дії агента вони зникають. При генотиповій мінливості різноманітні ознаки бактерій успадковуються. Ця мін-ливість виникає внаслідок мутацій, трансформацій, коньюгацій і трансдукцій.

Вивчення модифікаційної мінливості бактерій. Гот у ют ь 2 чашки Петрі, одна з яких містить м’ясо-пептонний агар з 0,1 % фенолу, інша – звичайний МПА. На поверхню чашок засівають культуру Proteus vulgaris. Посіви інкубують у тер-мостаті при температурі 37 °С протягом доби. Потім вивчають особливості росту мікробів на поверхні агару, роблять мазки, забарвлюють їх за Грамом і розгляда-ють під імерсійним об’єктивом. На контрольному середовищі (МПА) вульгарний протей представлено невеликими грамнегативними паличками, які мають тенден-цію до повзучого росту по поверхні середовища. На агарі з фенолом спостері-гається тенденція до утворення ізольованих колоній, в мазках видно ниткоподібні форми бактерій, часом із колбоподібними потовщеннями на кінцях.

Фенол як фактор модифікаційної мінливості може викликати втрату рухли-вості протеїв. Для її перевірки добову культуру P. vulgaris засівають у дві про-бірки: одна з них містить звичайний МПБ (контроль), інша – 0,1 % феноловий МПБ. Через добу культивування при температурі 37 °С у висячій краплі перевіря-ють рухливість збудників.

У контрольній пробірці вони зберігають рухливість, у дослідній – мікроби нерухомі. Для доведення природи модифікаційної мінливості мікроби засівають на звичайний м’ясо-пептонний агар і після 18-24-годинного культивування пере-віряють біологічні ознаки, в яких у цьому випадку спостерігається реверсія.

Метод реплік для виявлення мутантів. На чашку Петрі із повноцінним м’ясо-пептонним агаром за добу до досліду засівають 0,1 мл добової бульйонної

Частина І. Загальна мікробіологія

культури E. сolі, розведеної до 10-³ ступеня із розрахунку, щоб виросло 100 ко­лоній. На наступний день готують мінімальне живильне середовище, яке не містить ростових факторів для бактерій (глюкозо-сольовий агар), і чашку з повноцінним середовищем. Для досліду використовують штамп-реплікатор, який представляє собою дерев’яний або металевий циліндр товщиною до 1 см з діаметром дещо меншим, ніж чашка Петрі (рис. 39). Його робоча поверхня вкрита оксамитом, вор-

саланом або іншим матеріалом, що має дрібні ворсинки. Відкривають чашку Петрі, на якій виросли колонії мікроор-

ганізмів (матрична чашка), і прикладають
до неї штамп-реплікатор. Після цього пе­
реносять колонії, які прикріпились до вор­
синок, на дослідну і контрольну чашки
Петрі (чашки-репліки) із відповідними се-
Рис 39 Метод реплік редовищами. Необхідно звернути увагу на

точне фіксування положення штампа-ре-плікатора на матричній чашці і чашках-репліках. Після добової інкубації при тем­пературі 37 °С вивчають колонії, що виросли на чашках і підраховують їх кількість. Відмічають колонії мікроорганізмів, які не виросли на мінімальному живильному середовищі. Вони є ауксотрофними мутантами, тому що нездатні синтезувати відповідні ростові фактори.

Ідентичний експеримент можна поставити для виділення мутантів, які є ре­зистентними до антибіотиків, не потрапляючи попередньо під їх вплив (селекцій­на дія).

Флуктуаційний тест Лурія і Дельбрюка для виявлення частоти спон­танних мутацій. Для того, щоб виявити частоту спонтанних мутацій, які зумов­люють стійкість до стрептоміцину ( Str^r варіанти), відбирають чутливий до цього антибіотика штам E.coli. З добової культури бактерій у стерильному ізотонічному розчині хлориду натрію готують суспензію клітин з концентрацією 1000-10000 клітин в 1 мл. Їх засівають у пробірку з 10 мл МПБ і в 10 пробірок з 1 мл аналогіч­ного середовища так, щоб концентрація мікробів коливалась у межах 100-1000 клітин в 1 мл. Після добової інкубації при оптимальній температурі (37 °С) з 1-ої пробірки роблять висів по 0,1 мл на 10 чашок Петрі, які містять по 100 ОД стреп­томіцину в 1 мл агару. Посів проводять за допомогою шпателя. Вміст інших деся­ти пробірок також засівають на аналогічні окремі чашки Петрі із стрептоміцином, кожну в об’ємі 0,1 мл, шпателем. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С протя­гом 18-20 год.

Якщо стрептоміцинорезистентні кишкові палички утворюються тільки після контакту мікробів із антибіотиком протягом доби, то їх число повинно було б бути приблизно однаковим на всіх 20 чашках Петрі. В іншому випадку, за умови перед-існування антибіотикостійких варіантів (мутантних), на чашках виростає неодна­кова кількість колоній мікроорганізмів. Це є прояв коливань (флуктуацій) кількості мутантних клітин залежно від часу формування мутацій.

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

Висів мікробів із пробірки, де знаходилось 10 мл живильного середовища, не дає таких флуктуацій мутантів, оскільки клітини рівномірно розподіляються в живильному середовищі.

Моделювання трансформації в мікроорганізмів. У досліді використовуєть­ся стрептоміциночутлива сінна паличка (Bac. subtilis Strs) і донорська ДНК анало­гічного мікроба, яка має гени, що кодують стійкість клітини до антибіотиків.

У стерильну пробірку наливають 0,5 мл бульйонної культури штама-реципі-єнта Bac. subtilis і додають 0,5 мл донорської ДНК з концентрацією 1 мкг/мл. Суміш інкубують у термостаті при 37 °С протягом 20-30 хв, потім додають 0,5 мл розчину хлориду магнію для руйнування ДНК, що не встигла проникнути в клітину-реци-пієнт Роблять серійні 10-кратні розведення трансформованої культури у стериль­ному ізотонічному розчині хлориду натрію до 10-⁵-10^-6 і проводять посіви матеріалу в об’ємі 0,1 мл за допомогою шпателя паралельно на чашки без антибіотика і з 100 ОД/мл стрептоміцину.

Після інкубації протягом 18-24 год при температурі 37 °С оцінюють резуль­тати досліду, вираховуючи частоту трансформації.

Наприклад, після посіву штама-реципієнта, який було розведено в 10000 (10-) разів, на поверхні середовища виросло 120 колоній бацил (1,2·108/мл). Посів 0,1 мл нерозведеного рекомбінантного штаму на середовище із стрептоміцином дав ріст 60 колоній (6,0·10²/мл). Отже, частота трансформації (ЧТ) дорівнюватиме:

ЧТ= 6,0⋅10 ₈ ² =5⋅10 -6 1,2⋅10

Таким чином, генетичні феномени знаходять широке практичне застосуван­ня в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промисловості, біо-технології, сільського господарства тощо.

Розділ 8

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 771 | Нарушение авторских прав