АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Виділення та титрування бактеріофагів

Вперше спонтанний лізис бактерій описав М.Ф. Гамалія в 1898 р. Детальні-ше явище розчинення дизентерійних бактерій якимось невідомим агентом дослі-див канадський мікробіолог Ф. д’Ерелль у 1917 р. Він назвав цей агент бактеріо-фагом. На основі вивчення феномена бактеріофагії були вирішені дуже важливі проблеми молекулярної біолоігї та генетики. Бактеріофаги виявились основною моделлю для дослідження тонкої структури гена, універсального генетичного ко д у, впливу радіації на спадкові структури організмів.

Більшість бактеріофагів мають форму сперматозоїда.

Вони складаються з гексагональної головки, в якій міститься

ДНК, хвостов ого відростка (стержня, оточеного білковим

чохлом), базальної пластинки з фібрилами – рецепторами.

Розмір голівки 60-100 нм. Її двошарова оболонка утворена

капсомерами, які оточують одну щільно скручену молекулу

ДНК. Порожнистий відросток довжиною 100-200 нм слу-

жить для прикріплення до поверхні бактерійної клітини та

її інфікування. Адсорбується фаг на клітині за допомогою

базальної пластинки та фібрил-рецепторів. Існує шість

морфологічних типів фагів: нитчасті, без відростка, з ана- ^{Рис. 86. Схема будови}

логом відростка, коротким відростком, з чохлом відростка, ^{бактеріофага:}

що не скорочується й з чохлом відростка, що скорочується _в ^а_– ^– _ст^го_ер^л_ж^ов_е^к_н^а_ь^;_; ^б_г ^–_– ^Д_{ч о}^Н_х^К_о^;_л;

(рис. 86).

д – базальна пластинка;

Хімічний склад фагів, як інших вірусів, представлений _{е – шипи; є – хвостові} нуклеїновою кислотою, білками, невеликою кількістю фібрили; ж – комірець.

Частина ІV. Вірусологія

ліпідів у оболонці. Переважна більшість фагів містить ДНК і лише окремі – РНК. За своїм складом фагові нуклеїнові кислоти не відрізняються від аналогічних струк-тур інших мікроорганізмів і вірусів. Всередині голівки є невелика кількість “внут-рішнього білка”. В дистальній частині відростка, під чохлом, міститься фермент лізоцим, який відіграє велику роль у проникненні фагової нуклеїнової кислоти в бактеріальну клітину.

У мікроорганізмів, виявляється, також існують “інфекційні хвороби”, і вик-ликають їх бактеріофаги. При цьому лізис бактерій під впливом фагів характери-зується строгою специфічністю. Для кожного виду як патогенних, так і сапрофіт-них мікроорганізмів існує свій індивідуальний бактеріофаг, який вибірково діє лише на “ свій” мікроб. Ця вибіркова спеціалізація дії може бути спрямована тільки на певну різновидність (або навіть певний штам), що має велике значення для ідентифікації збудників інфекційних хвороб, їх окремих фаговарів. Це допомагає епідеміологам і клініцистам встановити джерело інфекції та намітити раціональні шляхи для її профілактики. Такі високоспеціалізовані бактеріофаги називають монофагами. Але в природі існують і поліфаги, які здатні лізувати кілька близь-ких між собою видів бактерій.

Бактеріофаги стійкі до дії багатьох факторів зовнішнього середовища. Зокре-ма, вони витримують високий тиск, зберігають активність при дії іонізуючого та рентгенівського випромінювання, а також при значеннях рН – 2,5-8,5. Однак вони швидко втрачають свої властивості при кип’ятінні, дії дезінфікуючих розчинів та ультрафіолетових променів.

Феномен бактеріофагії можна спостерігати як на рідких, так і на щільних живильних середовищах. Якщо в пробірку з МПБ, де росте кишкова паличка, до-дати декілька крапель відповідного бактеріофага, то через певний час відбувається просвітління мутної суспензії бактерій за рахунок дії фагів. Для вивчення лізису клітин на щільних живильних середовищах їх попередньо засівають мікроорга-нізмами, а потім наносять бактеріофаги. Через добу на фоні суцільного газону бактерій утворюються зони, де ріст відсутній. Такі зони мають, як правило, круг-

лу форму і виникають внаслідок літичної дії бакте-ріофагів. Їх називають негативними колоніями або бляшками бактеріофагів (рис. 87).

Залежно від наслідків взаємодії фагів з бакте-ріальною клітиною, вони поділяються на віру-лентні та помірні.

Вірулентні бактеріофаги проникають всереди-ну клітини, спричиняючи її лізис. Взаємодія їх з клітиною складається з ряду етапів, притаманних практично всім вірусам.

Коли з клітиною взаємодіють помірні бактер-

_(“б ^Р _л ^и _я ^с _ш ^{. 8} _к ⁷ _и ^. _” ^С_{) н}^те_а^р _б^и_а^л_к^ь_т^н_е^і_р ^п_{і а}^л_л^я_ь^м_н^и_ому іофаги, частина клітин залишається неушкодженою

_{газоні після зараження} ними, тому що спостерігається явище лізогенії –

_{бактеріофагом.} інтеграції генома бактеріофага в геном клітини.

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

Такий фаг, який вмонтовано в хромосому клітини, називається профагом. Мікро-організми з профагом називаються лізогенними бактеріями, і при дії деяких фак-торів (іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання, мутагенів) вони здатні до продукції помірного фага втрачаючи свою лізогенність. Лізогенізація має ве-лике біологічне значення й широко поширена у мікробному світі, тому що під впливом бактеріофагів можуть суттєво змінюватись біологічні властивості бак-терій. Таке явище називають фаговою конверсією. Доказана можливість пере-творення нетоксигенних дифтерійних паличок у токсигенні під впливом лізоген-ізації їх помірним бактеріофагом, який несе в своєму геномі tox+-гени. Саме вони забезпечують синтез дифтерійними паличками сильного екзотоксину. Доведена роль бактеріофагів у забезпеченні продукції токсинів збудників ботулізму, стафі-лококів та інших бактерій. У деяких випадках під впливом помірних бактеріо-фагів можуть змінюватись антигенні властивості бактерій кишкової групи, вібрі-онів, ферментативна активність мікробів, їх резистентність до антибіотиків.

Помірні бактеріофаги відіграють роль типових плазмід. Їх використовують як моделі для вивчення актуальних проблем генетики мікроорганізмів, в генно-інженерних дослідженнях і біотехнологічних процесах.

Бактеріофаги широко розповсюджені в природі. Вони зустрічаються в будь-яких середовищах довкілля: грунті, воді, стічних водах – всюди, де є відповідні їм види мікроорганізмів. Фаги знайдено в кишечнику та виділеннях людей, тварин, птахів, плазунів, риб. Відповідно звідси в навколишнє середовище потрапляють бактеріофаги численних збудників інфекційних захворювань: черевного тифу та паратифів, сальмонельозів, ешерихіозів, дизентерії, холери та ін.

Одержують бактеріофаги або з лізогенних культур мікроорганізмів, або з навколишнього середовища, заражаючи матеріалом відповідні бактерії. Для цьо-го досліджуваний матеріал центрифугують, для осадження твердих частинок, а надосадову рідину в об’ємі 1 мл вносять у 30 мл м’ясо-пептонного бульйону, який попередньо засіяний 1 мл 6-18-годинної культури бактерій. Через 18-24 год інку-бації при температурі 37 °С посів фільтрують через бактеріальний фільтр, розво-дять у 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 разів, додають 0,05-0,1 мл культури мікроорганізмів та інкубують протягом доби при оптимальній температурі. Як контроль використо-вують культуру бактерій без бактеріофагу. Якщо в матеріалі присутній бактеріо-фаг, середовище залишається прозорим внаслідок лізису бактерій фагами, в той час як у контрольній пробірці відбувається ріст бактерій (середовище стає мутним).

Для визначення наявності інфекційних бактеріофагів використовують метод Граціа – метод агарових шарів. Він полягає в тому, що попередньо матеріал, який містить бактеріофаг, розводять м’ясо-пептонним бульйоном: 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4. Після цього по 1 мл кожного розведення вносять в 2,5 мл розтопленого 0,7 % м’ясо-пептонного агару, додають 0,1 мл індикаторних мікроорганізмів, ретельно перемішують і виливають у чашки Петрі на поверхню підсушеного щільного 1,5 % м’ясо-пептонного агару. Чашки залишають на 30 хв при кімнатній температурі для застигання агару і поміщають у термостат при температурі 37 °С на добу.

Частина ІV. Вірусологія

У разі наявності бактеріофагів спостерігають появу окремих стерильних плям – “негативних” колоній (“бляшок”) – зон лізису мікроорганізмів.

Титруючи фаги за методом Граціа, після добової інкубації підраховують число “ негативних” колоній бактеріофагів. Кількість цих плям відповідає кількості фагів у засіяній суспензії. Виходячи з цього, можна підрахувати число фагових корпускул в 1 мл вихідної суспензії (титр бактеріофагів): число колоній множать на розведення бактеріофагів. Наприклад, при розведенні 10^-4 з’явилось 50 колоній, отже, титр фагів дорівнює: 50×10^-4 або 5×10^-5 в 1 мл.

Для визначення титру бактеріофагів за методом Аппельмана готують ряд пробірок із м’ясо-пептонним бульйоном, в яких розводять досліджуваний фаг (табл. 69).

Таблиця 69

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1783 | Нарушение авторских прав