 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Молекулярно-генетичні методиДля виявлення та ідентифікації бактерій, вірусів, грибів і найпростіших останнім часом почали широко використовувати молекулярно-генетичні методи. Реакція гібридизації ДНК і РНК (реакція генних зондів). Послідовність нук-леотидів ДНК і РНК є унікальною для геномів всіх мікроорганізмів. Будь-яку ділян-ку нуклеїнової кислоти можна визначити за допомогою комплементарної копії ДНК чи РНК, міченої ферментом або радіоактивною міткою (ДНК- і РНК-зонди). Такі зонди отримані для більшості патогенних бактерій і вірусів. За їх допомогою проводять ідентифікацію ДНК або РНК збудників бактеріальних і вірусних інфекцій у клінічному матеріалі. Реакція молекулярної гібридизації є дуже чутли-вою і високоспецифічною. Вона дає змогу виявляти ДНК або РНК в дуже малих кількостях (1-10 пг). Методика реакції генних зондів зводиться до того, що виділені з патологіч-ного матеріалу ДНК або РНК збудників денатурують і наносять на спеціальні мем-брани з нітроцелюлози. Після чого вносять ДНК- або РНК-зонди, витримують певний час, роблять багаторазову промивку, щоб видалити реагенти, що не проре-агували. Якщо використовували зонди з радіоактивною міткою, результат визначають за допомогою γ-лічильника. У випадку, ко л и зонд мічений ферментом (наприк-лад, пероксидазою), то до такого зонда додають субстрат (наприклад, ортофеніл-діамін). Ферментація субстрату призводить до зміни кольору, який можна спосте-рігати неозброєним оком. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – один із найновіших методів вияв-лення та ідентифікації бактерій і вірусів у досліджуваних матеріалах. Принцип реакції базується на багаточисленному копіюванні (селективній ампліфікації) до-сліджуваної ДНК ферментом ДНК-полімеразою. Утворені копії ДНК ідентифіку-ють за допомогою методу електрофорезу. Реакцію проводять в три етапи. На першому етапі при температурі 95 °С про-ходить денатурація двониткової молекули ДНК, її розплетення і розходження ниток. Частина І. Загальна мікробіологія На другому етапі (ренатурація) відбувається гібридизація праймерів, тобто утворення дволанцюгових комплексів праймер-матриці, які необхідні для ініцію-вання синтезу ДНК. Температура суміші при цьому знижується до 55 °С. На етапі синтезу (75 °С) проходить подовження комплементарних ниток ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Проводять 15-35 циклів синтезу. Багаторазове повторення приводить до збагачення ДНК у досліджуваному матеріалі. Метод ПЛР дуже чутливий. Його використовують для виявлення будь-якого інфекційного агента, якщо відома нуклеотидна послідовність гена (або його фрагмен-та), специфічного виключно до даного збудника. Доцільно використовувати ПЛР у тих випадках, коли бактерії чи віруси мають високу мінливість і знаходяться у до-сліджуваному матеріалі в малій кількості (навіть одна молекула геномної ДНК). Зараз ПЛР належить до високоефективного молекулярно-генетичного методу, який доступний багатьом лабораторіям. Тривалість дослідження становить 2-3 години. Особливо доцільно використовувати його при визначенні та ідентифікації збудників туберкульозу, сифілісу, гонореї, мікоплази, вірусів СНІДу, герпесів, ге-патитів, рота- та ентеровірусів. Розділ 5 Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 868 | Нарушение авторских прав |