АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій може здійснюватись за двома основними напрямками. Перший – виявлення та ідентифікація вірусів або їх ко м -понентів в організмі хворого (вірусологічна діагностика). Другий напрямок – ви-

Частина ІV. Вірусологія

явлення специфічних противірусних антитіл у сироватці крові (серологічна діаг-ностика). Оскільки антитіла з’являються не зразу після проникнення вірусів в організм, а потім їх титр протягом деякого часу зростає, діагностичну цінність має визначення приросту титру антитіл. Саме тому всі імунологічні реакції став-ляться з парними сироватками, перша з яких береться у хворого на початку захво-рювання, а друга – через 2-3 тижні. Оскільки застосування цього методу практич-но підтверджує перенесення захворювання, його ще називають ретроспективною діагностикою. Практично для всіх вірусних інфекцій реакції, які використовуються з цією метою, вважаються позитивними, якщо в досліді виявлено чотирикратний і більше приріст титру антитіл.

Третя група методів – експрес-діагностика вірусних інфекцій. Використання цих чутливих і надійних імунологічних тестів дозволяє значно прискорити лабо-раторну діагностику захворювань.

Виявлення вірусів. Для виділення вірусів, необхідних для подальшого їх дос-лідження з метою ідентифікації, дуже важливо провести правильний забір, швид-ке транспортування матеріалу до лабораторії, раціональний вибір тест-системи (курячі ембріони, культури клітин, лабораторні тварини).

Для вірусологічного дослідження матеріал краще збирати у перші дні захво-рювання. Від правильного його забору залежить хід подальшого вірусологічного дослідження. Залежно від проявів хвороби досліджуваним матеріалом може бути кров, змиви з носо- і ротоглотки, харкотиння, рідина з пухирців, спинномозкова рідина, сеча, фекалії, шматочки органів і тканин людини, отриманих при дослі-дженні трупів, матеріал від лабораторних тварин тощо. Одержаний матеріал не-обхідно зберігати за умов збереження активності вірусів. То м у його слід тримати (заморозити) при температурі -20 °С. Для транспортування вірусів можна викори-стати термоси, які заповнюються сухим льодом.

Досліджуваний матеріал, який не контамінується сторонньою флорою (кров, плазма, сироватка, спинномозкова рідина), може бути безпосередньо використа-ний для зараження тест-систем. Допустимим є розведення його фосфатно-буфер-ним розчином рН 7,6. Якщо досліджуються шматочки тканин, вони спочатку по-дрібнюються в стерильних умовах до гомогенного стану, потім додається фосфат-ний буферний розчин, одержана суспензія центрифугується протягом 10 хв при 1500-2000 об/хв. З метою зараження використовують надосадову рідину.

Однак у багатьох випадках досліджуваний матеріал (фекалії, змиви з рото-глотки, носових ходів тощо) може містити бактеріальну флору, яка при подальшо-му зараженні тест-систем спотворюватиме результати досліджень, включаючи їх загибель. Тому в лабораторіях використовують методи знищення бактерій в дос-тавлених взірцях. Надійним методом є обробка матеріалу антибіотиками пеніци-ліном і стрептоміцином у концентрації 500-1000 ОД/мл, у разі простих вірусів – ефіром. Допустимим вважається використання спеціальних антибактеріальних фільтрів або центрифугування матеріалу при невисоких швидкостях. У цьому ви-падку бактерії опускаються з осадом на дно. Супернатант підлягає подальшому ультрацентрифугуванню, і його потім використовують для зараження.

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

Зараження курячих ембріонів. Курячі ембріони 6-12-денного віку є зруч-ною моделлю для виділення та подальшої ідентифікації вірусів. Після зараження їх інкубують у термостаті при температурі 36-38 °С протягом декількох днів.

Існує два способи зараження курячих ембріонів – відкритий і закритий (рис. 83). Перед проведенням зараження відбирають ембріони, у яких візуально немає пошкодження шкаралупи. Їх просвічують за допомогою овоскопа і відміча-ють межу повітряного мішка. При відкритому способі шкаралупу над мішком об-робляють спиртом і розчином йоду, за допомогою гострих ножиць зрізають шка-ралупу, знімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зара-ження. Отвір закривають спеціальною скляною кришкою або шкаралупою і герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При закритому способі зараження шкаралупу над повітряним мішком також обробляють розчином йоду і спиртом, потім роблять колючим інструментом отвір у шкаралупі і вводять за допомогою шприца з товстою голкою 0,1-0,2 мл вірусміст-кого матеріалу під контролем овоскопа. Отвір заливають стерильним розплавленим парафіном, а ембріони закладають у термостат.

Для виділення вірусів у курячих ембріонах їх можна заражати на хоріоналан-тоїсну оболонку, в алантоїсну порожнину, порожнину амніону, жовтковий мішок тощо. При зараженні на хоріоналантоїсну оболонку після зняття шкаралупи над повітряним мішком обережно відшаровують верхній і нижній листки підшкара-лупної оболонки і наносять матеріал на відповідну оболонку.

В алантоїсну порожнину матеріал вводять закритим способом через невели-кий отвір у шкаралупі на глибину 10-15 мм у безсудинній ділянці хоріоналантоїс-ної оболонки.

При зараженні в амніотичну порожнину використовують ембріони старшого віку. Зараження можна проводити відкритим і закритим способами. При першому після знаходження хоріоналантоїсної оболонки в ній роблять отвір, захоплюють стерильним пінцетом амніотичну оболонку і вво-дять матеріал з вірусами. При закритому способі вірусмісткий матеріал вводять на глибину до 20-25 мм за допомогою голки, яку спрямовують до тіла ембріона.

Для зараження в жовтковий мішок викорис-товують 3-8-денні ембріони, тому що в них жовт-ковий мішок займає значну частину порожнини яйця. Зараження проводять закритим способом.

Заражені ембріони інкубують у термостаті
протягом 2-4 діб. Потім їх охолоджують до тем-
ператури 4 °С протягом однієї доби для макси- Рис. 83. Курячий ембріон:

мального звуження судин. Розтинають ембріони ^{1 – хоріоналантоїсна оболонка;}
в стерильних умовах, попередньо обробивши _пор²_{о ж}^– _н^п_и^о_н^р_а^{о ж}_ам^ни_н^н_іо^а_н ^а_а ^л_; ^а₄ ^н _–^{т о}_ж^{ї с}_о^а_в^;_т ³_{к о}^–_вий
шкаралупу йодом і спиртом. Матеріал із порож- _{мішок; 5 – повітряний мішок;}
нин ембріона відсмоктують стерильним шпри- _{6 – підшкаралупна оболонка.}

Частина ІV. Вірусологія

цом. У разі потреби досліджують оболонки і сам ембріон, які після виймання поміщають у стерильні чашки Петрі.

Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають характерну цитопа-тичну дію, яка проявляється утворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналан-тоїсної оболонки. Вони опуклі, мають дрібні розміри, білуватий колір (рис. 84).

Таким чином, визначити наявність вірусів у матеріалі з курячих ембріонів можна за їх цитопатичною дією. Однак більшість вірусів репродукується в ньому без зовнішніх проявів ураження. Тоді для індикації вірусів застосовують реакцію гемаглютинації. Принцип її полягає в тому, що віруси здатні, адсорбуючись на мембрані еритроцитів, викликати їх аглютинацію. Кількість віріонів в ембріоні визначають за титром гемаглютинації - найбільшим розведенням матеріалу, при якому ще виявляють склеювання еритроцитів. Титрувати віруси можна також при культивуванні їх на шматочках хоріоналантоїсної оболонки. Для цього в стерильні лунки плексигласових пластин вносять шматочки шкаралупи, на якій знаходить­ся неушкоджена хоріоналантоїсна оболонка. Потім у цих лунках роблять розве­дення матеріалу, що містить віруси. Їх закривають спеціальними стерильними пла­стинами з фольги, і культивують віруси протягом двох-трьох діб при температурі 35-37 °С. Пізніше в кожну лунку вносять 0,5 % завись еритроцитів курки і через деякий час за умови наявності вірусів спостерігають випадання осаду еритроцитів у вигляді перевернутої парасольки.

Зараження лабораторних тварин. Численні лабораторні тварини широко використовуються у вірусології для виділення та ідентифікації вірусів, отримання специфічних противірусних сироваток, вивчення різноманітних аспектів патоге­незу вірусних захворювань, розробки способів боротьби із захворюваннями та їх профілактики. Найчастіше використовують білих мишей різного віку (навіть одно-і дводенного), білих щурів, гвінейських свинок, кролів, ховрахів, бавовникових щурів, мавп та інших.

Існують різноманітні способи зараження тварин залежно від тропізму вірусів, клінічної картини захворювання тощо. Досліджуваний матеріал можна вводити через рот, у дихальні шляхи (інгаляційно, через ніс), нашкірно, внутрішньошкір-

но, підшкірно, внутрішньом’язово, внутрішнь-

fs&F&i¹ ^%*foul овенно, внутрішньоочеревинно, внутрішньо-
4ЕІ&^ПШУ серцево, на скарифіковану рогівку, у передню
№& Й камеру ока, у мозок.

Для виділення вірусів простого герпесу натуральної віспи використовують зараження лабораторних тварин (кроликів) на скарифіко­вану рогівку ока. При дослідженні вірусів ге­патиту А вводять досліджуваний матеріал че­рез рот. При виділенні вірусів з нейротропни-ми властивостями, таких як арбовіруси, віруси _Рис Z _{Утворення бляшок на}™ сказу, Коксаки доцільно заражати білих мишей "_{раження вірусом вісповакцини} (1-2-денних сисунців) у мозок. Для цього ма-

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

теріал попередньо обробляють антибіотиками для деконтамінації від бактерій. Відбирають групу мишей-сисунців (6 штук) і вводять у мозок до 0,02 мл матеріа-лу дещо вище орбітального горбика. Тварин, які загинули протягом 24 год після введення матеріалу, бракують, вважаючи, що їх загибель настала внаслідок трав-матичних ушкоджень. За рештою тварин спостерігають до появи клінічних ознак захворювання (2-4 тижні). Їх забивають, дотримуючись правил роботи з інфікова-ними тваринами, а органи досліджують на наявність вірусів.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використову-ють для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічен-ня розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані куль-тури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграції ферментативною обробкою. Для цьо-го отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25 % розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв’язків між клітинами) можна проводити при температурі 37 °С або 4 °С. Після цього суспензію центрифугу-ють, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визна-чають при підрахунку в камері Горяєва.

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин або їх росту, бувають природними або синтетичними (штучними). Природні сере-довища – сироватка крові великої рогатої худоби, рідини із серозних порожнин, продукти гідролізу молока, різноманітні гідролізати (5 % гемогідролізат, 0,5 % гідролізат лактальбуміну) або екстракти тканин. Їх хімічний склад допомагає ство-рити умови, які подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недо-ліком таких середовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний склад компонентів, які входять до їх складу, може змінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже їх хімічний склад стандартний, тому що їх одержують, комбінуючи різноманітні сольові роз-чини (вітаміни, амінокислоти) в штучних умовах. До таких найбільш вживаних розчинів належать середовище 199 (культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин), середовище Ігла (містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин), середовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин Хенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмиван-ня клітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в лабораторі-ях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, аденові-русів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, аденовірусів, вірусів кору,

Частина ІV. Вірусологія

паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої мавпи (культивування поліо-вірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих ембріонів (культивування різно-манітних арбовірусів), нирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденові-русів, пікорнавірусів, реовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання суворих правил асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування мікроорганізмами, гри-бами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матеріалу або повітря спричиняє їх загибель. То д і неможливо оцінити цитопатичний ефект вірусів, оскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобі-гання цього до живильних середовищ і досліджуваного матеріалу додають розчи-ни антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну (100 ОД/мл, стрептоміци-ну (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, лінкоміцину, протигрибко-вих препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або інших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур клітин є немож-ливість тривалий час підтримувати їх у лабораторних умовах, адже вони здатні витримувати тільки до 10 пасажів in vitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони представляють собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту і розмноження. Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи тваринних тка-нин, що мають змінений каріотип. Вони широко використовуються в лабораторній практиці, оскільки здатні швидко та інтенсивно розмножуватись у пробірках і чут-ливі до багатьох вірусів. Їх отримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у вигляді одношарових культур, прикріп-лених до поверхні скла, у спеціальних матрацах, флаконах або пробірках. Найча-стіше використо ву ють лінії к у л ь т у р клітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp-2 (карцинома г о р т а н і людини), КВ (карцинома ротової порожнини людини), RD (раб-доміос аркома людини), RH (нирка ембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи), СПЭВ (нирка ембріона свині), ВНК-32 (нирка сирійського хом’яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин відбирають ті з них, які мають типову морфо-логію, чітко відмежовані одна від іншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні клітини. Вони представляють собою культури клітин одного типу, мають диплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отри-мання вакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідни-ми вірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної активності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, че-рез що їх рідко використовують у практиці звичайних вірусологічних лабораторій. Найчастіше користуються лініями культур, які одержано із фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього спочатку одер-жують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у живильному середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10⁶ в 1 мл. Для стабілізації клітин до складу середовища додають 10-20 % сироватки крові та гліцерин. Отри-

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

ману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і поступово заморожу-ють до –20 °С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при температурі –196 °С. Доведено, що за таких умов життєздатність культур клітин не змінюється протягом невизначеного часу. У разі потреби культури швидко роз-морожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38 °С.

Деколи у вірусологічній практиці використовують культури органів. Вони представляють собою виготовлені у стерильних умовах зрізи органів тварин, які протягом певного часу (дні, тижні) зберігають свою життєдіяльність в особливих умовах культивування.

Для зараження тканинних культур використовують моношарові культури. З цією метою культури клітини вирощують у флаконах, пробірках, матрацах, які розташо-вуються горизонтально, щоб клітини могли прикріпитись до скла. Перед заражен-ням їх проглядають під мікроскопом, відбирають пробірки, де є гарно сформований моношар клітин. Для зараження використовують 6-8 пробірок і таку саму кількість зберігають для контролю. Безпосередньо перед експериментом змінюють живиль-не середовище у пробірках, промиваючи їх розчином Хенкса. Інокулюють у кожну пробірку 0,2 мл досліджуваного матеріалу, а потім інкубують у термостаті при тем-пературі 37 °С протягом 1-2 год для адсорбції вірусів на поверхні клітин. Після цього видаляють матеріал, знову промивають культуру розчином Хенкса для вида-лення неприкріплених вірусів і токсичних субстратів і додають живильне середо-вище (середовище 199 або середовище Ігла з 2 % сироватки крові великої рогатої худоби чи гідролізат лактальбуміну). Пробірки культивують у термостаті при 37 °С протягом 1-2 тижнів, постійно проглядаючи їх і фіксуючи результати.

Внаслідок розмноження вірусів у культурі клітин у них виникають дегенера-тивні зміни, які позначаються як цитопатична дія вірусів (ЦПД). Ступінь їх вира-ження визначається видом вірусів, їх інфікуючою дозою, фізіологічними особли-востями клітин тощо. В одних випадках ці зміни виникають через декілька днів після зараження (віруси поліомієліту, ЕСНО, грипу), в інших – через декілька тижнів і навіть місяців (аденовіруси, віруси гепатиту А). Для зараження найчас-тіше використовують дози вірусів, які дорівнюють 1000-10 000 ЦПД₅₀ (ЦПД₅₀ – така цитопатична доза вірусів, яка викликає дегенеративні зміни в 50 % пробірок, що містять заражені культури клітин).

Виявляти віруси в культурі тканин можна за феноменом бляшкоутворення. Останнім часом досліджують утворення бляшок під бентонітовим живильним покриттям. Попередньо готують десятикратні розведення досліджуваного матер-іалу, яким заражають відповідні культури клітин. Після 30-хвилинної інкубації їх відмивають стерильним фіpозчином і заливають бентонітовим покриттям, яке містить бентонітовий гель, розчин Ерла, нативну бичачу сироватку, гідрокарбонат натрію, дистильовану воду і розчини антибіотиків для пригнічення сторонньої мікрофлори. Адсорбуючись на поверхні клітин, бентоніт надає моношару клітин молочного кольору. Внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується тільки первинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється формуванням вог-нищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок (див. вкл., рис. 97).

Частина ІV. Вірусологія

За морфологічними змінами в культурі клітин можна виділити декілька типів прояву цитопатичної дії. Її особливості дозволяють провести попередню діагнос-тику захворювання (рис. 85).

При повній дегенерації клітинного моношару спостерігаються зміни в пере-важній більшості клітин. Вони гинуть, відокремлюються від скла. Окремі кліти-ни, що залишаються живими, змінюють свою морфологію, в них помітний пікноз ядра і цитоплазми. Такий тип дії притаманний пікорнавірусам – вірусам поліомі-єліту, Коксаки, ЕСНО. Для часткової дегенерації не характерне відокремлення всіх клітин від скла.

Для збудників кору, епідемічного паротиту, парагрипу, респіраторно-синци-тіальних вірусів характерний симпластоутворюючий тип ЦПД. При цьому вини-кають багатоядерні гігантські клітини (симпласти або синцитії). Аденовіруси ви-кликають утворення скупчень великих округлих клітин, які нагадують грона (круг-локлітинна дегенерація). При репродукції риновірусів утворюються округлі клітини, які мають відростки, а при розмноженні герпесвірусів спостерігається формування подібних клітин однакового розміру, які розкидано по всьому моно-шарі. Онкогенні віруси стимулюють клітинну проліферацію (проліферативний тип змін), при якій спостерігається формування декількох шарів клітин.

Окремі віруси (віруси краснухи, кримської геморагічної гарячки) не здатні викликати видимих дегенеративних проявів з боку клітин. У таких випадках для їх виявлення використовують феномен інтерференції, при якому клітинні культу-ри паралельно заражають іншими вірусами, здатними викликати ЦПД.

Ступінь вираження дегенеративних змін оцінюють за чотири-плюсовою сис-темою: (4+) – означає, що відбувається деструкція всіх клітин, (3+) – у 75 % їх, (2+) – у 50 %, (+) – до 25 % клітин, (+) – ЦПД проявляється в окремих клітинах.

Досить часто як прояв цитопатичної дії віруси утворюють внутрішньоклі-тинні включення. Вони можуть локалізуватись як внутрішньоядерно, так і в ци-топлазмі клітин. Їх утворення, форма, величина, наявність у них вірусних нуклеї-нових кислот є важливим моментом при проведенні вірусологічної діагностики захворювань. Такі включення утворюють віруси сказу (тільця Бабеша-Негрі), на-туральної віспи (тільця Гварнієрі), простого герпесу (тільця Ліпшютца), аденові-руси, віруси грипу та інші.

Розділ 12. Будова і класифікація вірусів

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за до-помогою методу Романовського-Гімзи. З цією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слю-ди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним ма-теріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції. При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками, кон ’югованими з флуорохромами. В ультрафіолетових променях люмінесцентно-го мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести на-явність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Часто для виявлення внутрішньоядерних або внутрішньоцитоплазматичних включень використовують відбитки тканин або органів, зскрібки клітин або гісто-логічні зрізи із тканин загиблих.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1978 | Нарушение авторских прав