АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ВІЛ-інфекція

Віруси імунодефіциту людини (ВІЛ) входять до родини Retroviridae, роду Lentivirus. Виділяють два види збудників синдрому набутого імунодефіциту – ВІЛ-І і ВІЛ-ІІ.

ВІЛ-1 має округлу форму, його розміри – 100-120 нм (рис. 94). Геном скла-дається з двох ідентичних „плюс”-ниток РНК, асоційованих з ревертазою та внут-рішніми білками. У геномі міститься 9 генів (3 структурних: gag, pol, env, і 6 не-структурних: tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, які кодують внутрішні білки вірусу, реверта-зу, ендонуклеазу, протеазу і специфічні білки зовнішньої оболонки). Серцевина віріона оточена білками капсиду й набуває конусоподібної форми. З нею асоційо-вані білки р7, р9, р24. Вона відділена від зовнішньої оболонки ще одним шаром білків – матриксним (р17). На зовнішній ліпідній оболонці розміщені глікопротеї-нові шипики, які складаються з двох субодиниць глікопротеїду (gp 41 i gp 120). У сукупності їх позначають як gp 160. У зв’язку з особливостями структури генома, ВІЛ має значну антигенну мінливість.

При нагріванні до 56 °С протягом 30 хв вірус інактивується. Він чутливий до дії спирту, ефіру, ацетону, іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання.

ВІЛ-2 за своєю будовою принципово не відрізняється від ВІЛ-1, однак має певні відмінності в складі геному, білків тощо.

Діагностика СНІДу – складна і відповідальна. Вона ґрунтується на основних клінічних проявах захво-рювання, а також результа-тах вірусологічних, серо-

логічних та інших методів дослідження, і вимагає їх комплексної оцінки.

Серологічна діагно- РНК і стика. Сьогодні в Україні ^{білки р9, р7} розроблена двоетапна си-стема лабораторної діаг-ностики захворювання, яка включає дослідження сироватки крові людини на наявність антитіл про-ти ВІЛ. Сироватка крові осіб з підозрою на ВІЛ-но-сійство обстежується за допомогою ІФА. Це відбу-

Рис. 94. Вірус імунодефіциту людини (схема).

Частина ІV. Вірусологія

вається в спеціалізованих лабораторіях з діагностики СНІДу, які розгортаються на базах санепідстанцій, станцій переливання крові, поліклінік, диспансерів, інфек-ційних лікарень тощо.

Основним матеріалом для дослідження є кров. Її забирають із ліктьової вени в об’ємі 5 мл. Отриману пізніше сироватку можна зберігати при температурі 4 °С протягом 7 днів. Запропоновано також використання способу “сухої краплини”. Він полягає в тому, що за допомогою стерильної голки проколюють палець і дек-ілька крапель крові наносять на стерильний диск, виготовлений з фільтрувально-го паперу. Висушені диски можуть зберігатись тривалий час (до 6 місяців) у полі-етиленових пакетах. У разі потреби за допомогою фосфатного сольового розчину імуноглобуліни переводять у рідкий стан і досліджують.

Доведено, що антитіла проти ВІЛ можна виявити в сльозах, слині, грудному молоці (IgA), спинномозковій рідині (в осіб з енцефалопатіями або неврологіч-ною симптоматикою), навіть у сечі. Допустимим вважається дослідження на на-явність антитіл рідини склоподібного тіла в трупів.

ІФА (в основному, непрямий) дозволяє визначити антитіла у будь-якому дос-лідженому матеріалі. Він є достатньо чутливим методом, що використовується у будь-яких лабораторіях світу. Антигени для цих тест-систем одержують або із за-ражених тканинних культур, або за допомогою рекомбінантних ДНК. В Україні використовують тест-системи “Антиген”, “Рекомбінант-ВІЛ”, “Скрин-ВІЛ”, “Комбі-ВІЛ”, фірми “Аbbott” та інші.

Слід відзначити, що антитіла у крові з’являються не зразу після попадання ВІЛ в організм, а не менш, ніж через 2-3 місяці, а деколи й довше (5-8 міс.), тому слід пам’ятати, що ІФА є малопридатною для діагностики вірусоносійства саме в серонегативний період. Одноразовий позитивний результат виявлення антитіл в крові не дає можливості підтвердити діагноз набутого імунодефіциту. Цю реак-цію рекомендують повторити тричі. Діагностичними вважаються два позитивних результати в трьох повторах. Така схема постановки реакцій зумовлюється тим, що сучасні тест-системи все ж таки можуть давати як псевдопозитивні, так і псев-донегативні результати.

Зразки крові, які дали два позитивних результати з трьох повторів, направля-ють у спеціалізовані лабораторії при науково-дослідних інститутах для підтвер-дження наявності ВІЛ-вірусоносійства за допомогою твердофазного імунофер-ментного аналізу – вестернблоту або імуноблоту (від англ. blott – пляма), реакції непрямої імунофлуоресценціїї або радіоімунної преципітації. Ці методи дозволя-ють виявити антитіла до певних вірусних білків.

Метод вестернблоту передбачає попереднє електрофоретичне розділення вірусних білків у поліакриламідному гелі з наступним переносом їх на спеціальні нітроцелюльозні мембрани. Після цього на фільтрах розганяються досліджувані зразки крові з подальшою ідентифікацією їх білків (антитіла проти певних струк-турних вірусних білків) за допомогою антивидових мічених сироваток. На нітро-целюльозних фільтрах з’являються кольорові смуги, що відповідають комплек-сам, утвореним вірусними структурними білками та антитілами сироватки віру-

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

соносія. Про позитивний результат реакції може свідчити наявність антитіл проти вірусних білків р24, p31, gp41, gp120/160.

При негативних результатах на фільтрах не видно характерних зон забар-влення.

Одним із ефективних способів визначення наявності антитіл проти ВІЛ у сироватці крові людини є використання реакції мікроаглютинації. Вона подібна до реакції непрямої гемаглютинації, однак замість еритроцитів, сенсибілізованих відповідним антигеном, тут використовують як основу частинки желатину або латексу. У випадку позитивного результату спостерігають за появою специфічного осаду в лунках планшет. Дана реакція дає подібні результати до ІФА, проте значно простіша за методикою постановки, швидше виконується, дає менше псевдопози-тивних результатів.

Іншим методом виявлення антитіл проти ВІЛ є реакція непрямої імунофлуо-ресценції. Для постановки цієї реакції використовують антиген, який одержують з перещеплюваних ліній лімфоцитів, заражених вірусами імунодефіциту. З них готують препарати фіксованих клітин, які можна зберігати протягом 2 місяців при температурі -20 °С. У разі необхідності скельця з нанесеним антигеном обробля-ють розведеними досліджуваними сироватками (1:10, 1:100, 1:1000 тощо), а потім люмінесцентною антисироваткою проти імуноглобулінів людини. Препарати до-датково контрастують синькою Еванса і вивчають у люмінесцентному мікроскопі.

Більш чутливим є метод радіоімунопреципітації. Як і при будь-якій імуно-логічній реакції в його основі лежить взаємодія антигенів ВІЛ з антитілами проти них. У цій реакції як антигени використовують білки ВІЛ, мічені радіоактивними ізотопами ¹²⁵I або ³⁵S.

Реакцію проводять у рідкій фазі, змішуючи гомологічні антигени (вірусні біл-ки gp120, gp41, p24, p17, p9 та інші) й антитіла (сироватка вірусоносія), внаслідок чого утворюються імунні комплекси. Вони взаємодіють із спеціальною системою, яка складається з білка А S. аureus, з’єднаного із сефарозою, внаслідок чого відбу-вається преципітація. Утворений комплекс за допомогою ультрацентрифугування осаджують у пробірках, видаляють надосадову рідину, залишаючи тільки субстрат антиген-антитіло-білок А-сефароза. На наступному етапі дослідження виклика-ють дисоціацію комплексів додецилсульфатом натрію, піддають їх електрофоре-зу в поліакриламідному гелі і за допомогою авторадіографії визначають молеку-лярну масу мічених ізотопами білків. Це дозволяє встановити, які саме вірусні білки знаходяться в імунних комплексах, отже, до яких вірусних білків утворю-ються антитіла. Цей метод є чутливішим, ніж імуноблот, проте вимагає спеціаль-ного обладнання, тому не використовується широко в лабораторній практиці.

Підсумовуючи вищевикладене, можна таким чином підійти до підтверджен-ня діагнозу ВІЛ-носійства. Одноразовий негативний результат на наявність ан-титіл, одержаний за допомогою ІФА, дозволяє зробити висновок про відсутність ВІЛ-інфікування. Два позитивних результати з трьох повторних досліджень сиро-ваток не дають змоги встановити діагноз вірусоносійства. Це можна зробити тільки після одержання позитивних результатів про наявність антитіл проти певних вірус-

Частина ІV. Вірусологія

них структурних білків за допомогою імуноблотингу або інших методів, що його замінюють.

Вірусологічна діагностика. Матеріалом для дослідження може бути кров, спинномозкова рідина, грудне молоко, сперма, біоптати при автопсії тощо. Для виявлення вірусу використовують електронну мікроскопію, зараження культур Т-лімфоцитів (CD₄-клітини). Для ідентифікації вірусів можливе використання ви-сокочутливих тест-систем ІФА, реакції непрямої імунофлуоресценції, характер-ної цитопатичної дії тощо.

Важливим для діагностики СНІДу є визначення провірусу в лімфоцитах, або вірусних нуклеїнових кислот у патологічному матеріалі. З цією метою широко використовують методи молекулярної гібридизації. Використання цього методу набуває важливого значення особливо через те, що серонегативний період при СНІДі може тривати декілька місяців. Висока чутливість запропонованого методу дозволяє виявити навіть поодинокі вірусні частинки в крові (0,1-1,0 нг нуклеїно-вих кислот). Принцип його полягає в тому, що в умовах in vitro викликається про-цес гібридизації між вірусною нуклеїновою кислотою (ДНК, РНК) та спеціальним зондом, який мічений радіоактивним фосфором ³²Р. Утворений комплекс достат-ньо легко можна ідентифікувати за допомогою авторадіографії. Однак викорис-тання ³²Р-зондів у певній мірі ускладнює цей метод, оскільки вони мають корот-кий (2 тижні) період напіврозпаду, вимагають дотримання суворих правил техні-ки безпеки при роботі з радіоактивними ізотопами тощо. Враховуючи це, перспективним напрямком є використання зондів, які можна виявити за допомо-гою кольорових ферментативних реакцій. Такою міткою є біотин (біотиновий зонд).

Існують різноманітні варіанти молекулярної гібридизації, серед яких найча-стіше застосовуються точкова гібридизація, блот-гібридизація, сандвіч-гібриди-зація, гібридизація in situ (в заражених тканинах).

Одним з варіантів молекулярної гібридизації розглядається полімеразно-лан-цюгова реакція, в основі якої лежить ампліфікація генів. Використання ДНК-полі-мерази, наприклад, з Thermophylus aquaticus дозволяє за кілька циклів ампліфі-кації значно збільшити кількість досліджуваних нуклеїнових кислот, внаслідок чого їх можна виявити будь-якими відомими методами – ІФА, електрофорез у полі-акриламідному гелі тощо. Ця реакція суттєво перевищує чутливість попередньо-го методу (на декілька порядків), тому може бути використана при дослідженні мікрооб’ємів матеріалу або таких тест-об’єктів, де іншими методами віруси іму-нодефіциту не виявляються, наприклад, змиви з носоглотки, слина.

Крім описаних методів діагностики, допустимим визнається виявлення ан-тигенемії, яка зумовлена білком р24. Цей р24-антиген можна визначити за допо-могою модифікованих методів ІФА.

Одержання позитивного результату при застосуванні одного з наведених ме-тодів є достатнім аргументом для встановлення етіологічного діагнозу ВІЛ-інфекції.

Вірусологічна діагностика СНІДу – достатньо складний процес, доступний для виконання тільки у високоспеціалізованих лабораторіях, де створюються всі

Розділ 14. Шпитальні інфекції

необхідні умови для роботи (захист персоналу від зараження під час культивуван-ня, очищення та концентрування ВІЛ) і є висококваліфіковані фахівці.

Таким чином, при наявності ВІЛ-інфекції у вірусоносіїв або хворих на СНІД можна виявити такі вірусспецифічні маркери: антитіла до ВІЛ, безпосередньо інфекційний вірус, провірус у ДНК уражених імуноцитів, вірусний антиген у си-роватці крові та інфікованих клітинах-мішенях.

Розділ 14

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 813 | Нарушение авторских прав