АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Схема постановки РНГА

Таблиця 19

Реакція аглютинації латекса (РАЛ) за своїм механізмом аналогічна РНГА, в якій беруть участь еритроцити, сенсибілізовані антигенами або антитілами. Для постановки РАЛ використовують сенсибілізовані частинки полістиролового ла­текса діаметром 0,5-1,2 мкм, які в присутності гомологічного імунологічного реа­генту (антигену або антитіла) склеюються. Ця реакція відбувається досить швид­ко (2-7 хв), що дозволяє застосовувати її як експрес-метод виявлення антигенів і антитіл.

Навантажені антитілами часточки латексу широко використовують для вияв­лення антигенів вірусів і бактерій. Наприклад, антигени стрептококів у мазках із зіву можна виявити вже через 10-60 хв. Збудників, які викликають запалення моз­кових оболонок (H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, C. neoformans), мож­на безпосередньо виявити протягом 15 хв. Латекс-аглютинація широко вживаєть­ся для ідентифікації антигенів ротавірусів, герпесвірусів тощо. Чутливість цих тестів сягає понад 90 %, а специфічність - 97-99 %. РАЛ використовують також для ідентифікації деяких бактерій (наприклад групи Streptococcus за Ленсфільд, групи Salmonella та інші.). Останнім часом у деяких латекс - системах замість поліклональних сироваток використовують частинки латексу, навантажені моно-клональними антитілами (наприклад, для виявлення S agalactiae).

Навантажуючи латекс антигенами, можна визначати наявність антитіл у си­роватці хворого. Таку модифікацію РАЛ використовують для виявлення протиг­рипозних, протикраснушних, протикорових антитіл тощо.

Реакцію аглютинації латексу можна проводити на склі або рівній пластма­совій пластинці темного кольору, додаючи до 1-2 крапель кожного розведення сироватки по 1 краплі латексного діагностикуму. Залежно від досліджуваного матеріалу, величини частинок латексу та активності діагностикуму облік резуль­татів можна проводити через 1-10 хв після змішування інгредієнтів.

При позитивній ре- ^^ х-^ ^^ ^^ х-, х-х ^-^
акції частинки латексу (шШ і Ш (Аї і jfcO і Ш) і • W * ї
склеюються, утворюючи ^ ^ ™ \&? 43/ W V_7
аглютинат, який добре Рис. 45. Результат постановки РНГА.

Частина ІІ. Імунологія

помітний неозброєним оком або при використанні лупи з невеликим збільшен­ням. У випадку негативної реакції суспензія латексу залишається мутною, без крупинок аглютинату і ділянок просвітління.

Ще простішою є РАЛ при використанні комерційних наборів США “Rubascan”. Одну краплю нерозведеної сироватки наносять на пластинку темного кольору яка входить в цей набір, розприділяють її піпеткою або бактеріологічною петлею в межах визначеного на пластинці кільця і вносять 1 краплю латексового антигенного діагностикуму Пластинку кладуть на столик ротатора у вологій ка­мері і через 8 хв проводять облік результатів.

Для ранньої діагностики вірусних інфекцій використовуєть модифікацію цієї реакції, яка дозволяє виявити у сироватці хворого специфічні IgM. З цією метою застосовують частинки латексу, сенсибілізовані вірусним антигеном. Спочатку в лунки полістиролової пластинки вносять антисироватку проти IgM людини, потім досліджувану сироватку хворого з підозрою на вірусну інфекцію. IgM - антитіла сироватки хворого міцно зв’язуються з антитілами проти IgM, які знаходяться в лунці, на них адсорбуються частинки латексу, які попередньо були навантажені відповідним вірусним антигеном. У випадку відсутності специфічних противі­русних IgM у сироватці частинки латексу вільно осідають на дні луночки у виг­ляді компактного осаду (гудзика) - реакція негативна. Така реакція характери­зується високою специфічністю і дає такі ж результати, як і значно складніші за постановкою імуноферментні методи.

Реакція коаглютинації (КОА). Д ля постановки КОА використовують золо­тисті стафілококи (штам Cowan 1). У клітинній стінці цих мікроорганізмів містить­ся білок А, який має значну спорідненість до Fc-фрагмента IgG людини і кролика. Тому молекули IgG після адсорбції на стафілококах, що мають білок А, орієнто­вані в оточуюче середовище своїми вільними Fab-фрагментами, в яких знаходить­ся активний центр антитіла (рис. 46).

Цим стафілококові діагностикуми відрізняються від інших антитільних пре­паратів, в яких носії (еритроцити, бентоніт, латекс) не мають специфічних рецеп­торів для Fc-фрагмента IgG. На таких інертних частинках молекули імуноглобулінів адсорбуються будь-якою ділянкою, без суворої просторової конфігурації.

Для одержання антитільного стафілококового діагностикуму культуру стафі­локока, яка виросла на рідкому живильному середовищі, центрифугують при 2500-3000 об/хв протягом 15 хв. Центрифугат двічі промивають ізотонічним розчином хлориду натрію, готують 10 % суспензію бактерій і фіксують їх 0,5-3,0 % форма-

■+£ ® W* і v*.

стафілококовий діагностикум антиген гі^^ ^^~ "^Т^"

Рис. 46. Схема реакції коаглютинації.

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

ліном протягом 20-120 хв. Після фіксації стафілококи промивають 4 рази ізотоні-чним розчином хлориду натрію і знову готують 10 % суспензію, яку прогрівають протягом 1 години при температурі 80 °С. Перед зберіганням до суспензії стафі-лококів додають мертиолят до кінцевої концентрації 1: 10000.

Для сенсибілізації в 10 % суспензію фіксованих стафілококів вносять рівний об’єм імунної сироватки кролика або її гамаглобулінової фракції у відповідному розведенні від 1:10 до 1:20. Стафілококи сенсибілізують імуноглобулінами впро-довж 15-30 хв при температурі 20-30 °С, після чого промивають ізотонічним роз-чином. Го т у ют ь 0,5-5,0 % суспензію, яку консервують азидом натрію і зберігають у холодильнику при температурі 4 °С.

Зазвичай, реакцію коаглютинації ставлять на скляних пластинках, змішуючи рівні об’єми (1-2 краплі) досліджуваного матеріалу (кров, сеча, слина, фільтрати фекалій та ін.) і стафілококового діагностикуму. Суміш ретельно перемішують і через 2-5 хв на темному фоні враховують результати. Використання темного фону – необхідна умова чіткої реєстрації реакції КОА, тому що при спостереженні за її результатами при звичайному освітленні лише на темному фоні чітко буде прогля-датись дрібнозерниста аглютинація стафілококів.

Кожен дослід повинен супроводжуватись декількома негативними контролями:

1) стафілококи, сенсибілізовані нормальною сироваткою + досліджуваний матеріал; 2) стафілококовий коаглютинуючий діагностикум + матеріал, який не містить збудника; 3) стафілококовий коаглютинуючий діагностикум + фосфатно-буферний розчин; 4) дослідуваний матеріал + фосфатно-буферний розчин.

Реакція КОА широко використовується для виявлення антигенів різних стреп-тококів, N. meningitidis i N. gonorrhoeae, H. influenzae, S. pneumoniae, шигел, саль-монел тощо.

На відміну від бактерій, які часто досліджують у чистій культурі, віруси зав-жди виявляють в якомусь біологічному матеріалі. Тому, щоб попередити неспе-цифічні реакції, необхідна адсорбція суспензією стафілокока матеріалу, в якому можуть міститись IgG (кров, фекалії). Для цього змішують рівні об’єми 10 % за-висі стафілококового реагенту і досліджуваного вірусного матеріалу. Суміш інку-бують протягом 30 хв при 37 °С, центрифугують і надосадову рідину використо-вують для подальшої роботи для виявлення в ній збудників хвороби.

Метод з успіхом використовується для ідентифікації вірусів грипу, параміксо-вірусів, ротавірусів, вірусів гепатиту В тощо.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) набула широкого розповсю-дження для діагностики вірусних інфекцій. Її можна застосовувати як для серо-логічної ідентифікації вірусів, так і для серологічної діагностики. Гемаглютина-ція – це феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Деякі віруси мають на своїй оболонці рецептори, комплементарні рецепторам поверхні еритроцитів певних тварин, і при додаванні до суспензії вірусів еритроцитів, останні склею-ються. Наприклад, вірус грипу аглютинує еритроцити курей, вірус кліщового енцефаліту – еритроцити гусей. Таким чином, у випадку гемаглютинації можна зробити висновок про наявність вірусу в досліджуваному матеріалі. Проте ця

Частина ІІ. Імунологія

реакція не імунологічна, том у що в ній не бере участі основна система – антиген і антитіло.

У той же час реакція гальмування гемаглютинації належить до серологічних реакцій імунітету. У РГГА специфічні противірусні антитіла, взаємодіючи з віру-сом і блокуючи поверхневі рецептори, позбавляють його здатності склеювати ерит-роцити (рис. 47).

Рис. 47. Схема реакції гальмування гемаглютинації.

Для постановки РГГА в лунках полістиролових планшет готують послідовні розведення сироватки в об’ємі 0,25 мл і змішують їх з аналогічною кількістю віру-совмістного матеріалу. Суміш ставлять у термостат при 37 °С на 30 хв, після чого в кожну лунку додають по 0,5 мл 1-2 % зависі еритроцитів (табл. 20).

Таблиця 20

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 982 | Нарушение авторских прав