АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Виділення чистої культури анаеробних бактерій

У лабораторній практиці часто доводиться працювати з анаеробними мікро-організмами. Вони більш вибагливі до живильних середовищ, ніж аероби, часті-ше потребують спеціальних ростових добавок, вимагають припинення доступу кисню при їх культивуванні, тривалість росту їх довша. Тому робота з ними склад-ніша, вимагає значної уваги бактеріологів і лаборантів.

Важливим є захист матеріалу, що містить анаеробні збудники від токсичного впливу атмосферного кисню. Том у матеріал із вогнищ гнійної інфекції рекоменду-ється забирати під час їх пункції за допомогою шприца, час між взяттям матеріалу та посівом його на живильне середовище повинен бути максимально коротким.

Оскільки для культивування анаеробних бактерій використовують спеціальні живильні середовища, які не повинні містити кисню і мають низький окисно-відновний потенціал (-20 -150 мВ), до їх складу вводять індикатори – резазурин, метиленовий синій тощо, які реагують на зміну цього потенціалу. При його зрос-танні відновлені безбарвні форми індикаторів змінюють свій колір: резазурин за-барвлює середовище в рожевий колір, а метиленовий синій – в голу бий. Такі зміни свідчать про неможливість використання середовищ для культивування анаероб-них мікробів.

Сприяє зниженню окисно-відновного потенціалу введення в середовище не менше 0,05 % агару, який, збільшуючи його в’язкість, сприяє зменшенню надхо-дження кисню. Це, в свою чергу, досягається ще й використанням свіжих (не пізніше двох годин після виготовлення) і редукованих живильних середовищ.

Слід врахувати, що через особливості бродильного типу метаболізму анае-робних бактерій вони вимагають багатших на живильні компоненти і вітаміни середовищ. Найчастіше використовують серцево-мозковий й печінковий настої, соєві та дріжджові екстракти, гідролітичний перевар казеїну, пептон, триптон. Обов’язковим є додавання факторів росту, таких як твін-80, гемін, менадіон, цільна або гемолізована кров.

Методи створення анаеробних умов. Враховуючи, що вільний молекуляр-ний кисень є токсичним для облігатно-анаеробних бактерій, обов’язковою умо-вою культивування таких мікроорганізмів є обмеження його доступу. Існує ряд методів (механічних, фізичних, біологічних), які дозволяють це забезпечити.

Фізичні методи. 1. Перед посівом бактерій на живильне середовище його обов’язково регенерують для видалення надлишку розчиненого кисню. З цією метою середовище кип’ятять протягом 15-20 хв на водяній бані, а потім швидко охолоджують до необхідної температури.

2. Для попередження проникненя кисню в середовище його заливають ша-ром стерильної вазелінової олії або парафіном.

3. Стовпчик живильного середовища у пробірках повинен бути достатньо високим (10-12 см). Кисень, як правило, дифундує в товщу стовпчика на глибину до 2 см, тому нижче створюються сприятливі умови для культивування анаероб-них мікробів.

Частина І. Загальна мікробіологія

4. Евакуаційно-замісний метод полягає у використанні анаеростатів. Вони представляють собою герметичні металеві або пластмасові банки, з яких можна викачати кисень і замінити його інертним газом (гелій, азот, аргон). Допускається використання трикомпонентної газової суміші, яка складається з 80 % азоту, 10 % диоксиду вуглецю та 10 % водню. Деколи допустимим вважається використання природного газу. Для поглинання кисню, який залишається в анаеростаті, викори-стовують паладієві каталізатори. З метою поглинання водяної пари використову-ють хлорид кальцію, силікагель тощо, які поміщають на дно анаеростата.

Хімічні методи. 1. Використання речовин, здатних поглинати кисень. З цією метою допустимим є застосування лужного розчину пірогалолу. При цьому вра-ховують поглинаючу активність речовини: на 100 мл ємності герметичної посуди-ни, в якій знаходяться чашки Петрі, використовують 1 г пірогалолу і 10 мл 2,5 N розчину гідроксиду натрію.

Киснезв’язуючий ефект має також гідросульфіт натрію (Na₂S₂O₄). Для зв’язу-вання кисню в 1 л повітря використовують суміш, яка складається з 100 мл свіжо-го 20 % розчину Na₂S₂O₄ і 16 мл 50 % гідроксиду калію.

2. Застосування речовин-редуцентів. Враховуючи, що ріст облігатно-анаероб-
них бактерій відбувається в середовищах з низьким рівнем окисно-відновного
потенціалу, до них додаються спеціальні відновлювачі: цистеїн (0,03-0,0,5 %), тіо-
гліколеву кислоту або тіогліколат натрію (0,01-0,02 %), сульфід натрію, аскорбі-
нову кислоту (0,1 %), різноманітні цукри.

Функції відновлювачів можуть виконувати шматочки паренхіматозних органів тварин (печінка, нирки, серце) або навіть рослин (картопля, інші коренеплоди).

Ступінь поглинання кисню або ступінь відновлення середовища вимірюють або електрометрично або за допомогою індикаторів (резазурин, нейтральний чер-воний, феносафранін).

3. Використання спеціальних газогенеруючих систем, які дозволяють ство-
рити безкисневі умови в мікроанаеростатах, транспортних пластикових пакетах
тощо. Однією з найпоширеніших є система “Gas Generating Box”. До її складу
входять хімічні генератори водню (борогідрит натрію) та вуглекислого газу (таб-
летки бікарбонату натрію та лимонної кислоти), а також паладієвий каталізатор,
який поглинає кисень.

Чашки з посівами поміщаються в мікроанаеростат, на дні якого знаходиться шар паладієвого каталізатору. Кінчик пакета “Gas Generating Box” надрізають но-жицями, і в нього наливають 10-15 мл води. Пакет розташовують у мікроанаеро-статі. Через 15-20 хв у ньому створюються анаеробні умови. Водень, який виді-ляється, взаємодіє з киснем, утворюючи воду, а вуглекислота продукується при взаємодії бікарбонату натрію з лимонною кислотою.

Біологічні методи. 1. Метод Фортнера. Метод полягає в спільному культи-вування на одному середовищі аеробних і анаеробних мікроорганізмів. Спочатку по діаметру чашки вирізають полоску агару шириною до 0,5-1,0 см. З одного боку засівають досліджуваний метралі, що містить анаеробні збудники, а з іншого – мікроби, що є індикатором анаеробних умов (Serratia marcescens або “чудесна па-

Розділ 4. Фізіологія бактерій

личка”). Краї чашки парафінують або закривають пластиліном. За деякий час на поверхні середовища виростають колонії як аеробних, так і анаеробних мікробів. При поглинанні кисню Serratia marcescens дає ріст блідо-рожевих або безбарвних колоній, а при порушеннях герметичності – яскраво-червоні. На іншій половині чашки виростають колонії анаеробних мікробів.

2. Мет од Хеннеля (“годинникових скелець”). Він є своєрідною модифікацією попереднього. Матеріал, що містить анаеробні збудники, засівається на поверхню живильного середовища діаметром 2-2,5 см. Зверху він покривається “годиннико-вим склом”, заповненим шаром МПА і засіяним Serratia marcescens. Аеробні мікро-би, поглинаючи кисень, створюють умови для сприятливого росту анаеробних збудників.

У високо спеціалізованих лабораторіях користуються спеціальною анаероб-ною технікою, яка включає використання живильних середовищ без кисню із відновлювачами, виконання посівів і пересівів в атмосфері інертних газів, вугле-кислоти тощо.

За останні роки створено стаціонарні анаеробні бокси, які містять все необх-ідне для створення анаеробних умов культивування, включаючи термостати. Як правило, такі камери заповнюються трикомпонентною газовою сумішшю. Бакте-ріолог працює в камері, перебуваючи зовні, застосовуючи гумові рукавиці, вмон-товані в неї. Таке устаткування має незаперечні переваги, які полягають у тому, що повністю виключається контакт кисню з досліджуваним матеріалом.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 2326 | Нарушение авторских прав