 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Мікроскопічне дослідження живих мікробівДля прижиттєвого вивчення мікроорганізмів використовують методи надав-леної й висячої краплі та спеціальні камери для тривалого спостереження за їх ростом, розмноженням, дією різних хіміотерапевтичних препаратів тощо. Пере-вагою цих методів є можливість досліджувати бактерії в неушкодженому вигляді, тоді як обробка мазків при їх висушуванні, фіксації та забарвленні часто супро-воджується зміною мікробних клітин. Значно легше, простіше і швидше можна виявити рухливість, що свідчить про наявність джгутиків. Цим широко користу-ються в практичних лабораторіях при диференціально-діагностичному визначенні видів збудників. Однак, ці методи мають і ряд недоліків. У живих бактерій, що активно руха-ються, важко виявляти деталі структури. При такому дослідженні можна мати лише загальне уявлення про їх морфологію. Разом з тим, дослідження у живому стані крупніших мікроорганізмів (гриби, найпростіші) дає змогу вивчати тонку струк-туру їх клітин краще, ніж у забарвлених препаратах. Ця перевага стає особливо виразною при дослідженні живих незабарвлених мікробів за допомогою фазово-контрастної та аноптральної мікроскопії. Необхідно завжди пам’ятати, що робота з живими збудниками більш небез-печна, вимагає виняткової обережності і навику. Після мікроскопії потрібно обов’язково занурювати препарати в дезінфікуючий розчин. Надавлена крапля. На середину предметного скла бактеріологічною петлею або піпеткою наносять краплю молодої (12-18 год) теплої бульйонної культури або іншого досліджуваного матеріалу. При густому рості культури її розбавляють фізіологічним розчином, оскільки наявність великої кількості мікробних тіл у полі зору утруднює спостереження за окремими бактеріями та їх рухливістю. Нанесе-ну краплю накривають покрівним скельцем, обережно накладаючи його пінце-том, щоб у надавленій краплі не з’являлись бульбашки повітря. Для цього по-крівне скельце краще не накладати зверху, а ставити його ребро біля краю краплі і повільно опускати, витісняючи повітря між предметним і покрівним скельцями. Вдало зроблена крапля заповнює весь простір між ними, але при цьому рідина не виступає за краї покрівного скельця. Якщо вона виступає, зайву її частину відсмок-тують шматочком фільтрувального паперу, утримуючи його пінцетом, після чого папір занурюють у дезінфікуючий розчин. Недоліком надавленої краплі є її швид-ке висихання. При необхідності довго розглядати препарат, краї покрівного скла заздалегідь змащують вазеліном. Висяча крапля – метод мікроскопічного дослідження живих мікроорганізмів, розроблений Р. Кохом в 1876 р. За його допомогою можна спостерігати розмно- Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів ження бактерій, характер їх рухливості, проростання спор у вегетативні форми, явище хемотаксису, дію фізичних і хімічних факторів, імунних сироваток тощо. Його також широко використовують для вивчення морфології грибів, найпрості-ших і спірохет. Як і в методі надавленої краплі, досліджують молоді культури, вирощені в рідкому або на щільному середовищі. Для виготовлення висячої краплі необхідні спеціальні предметні скельця, в центрі яких є напівсферичне заглиблення (лунка). Невелику краплю негустої сус-пензії бактерій петлею або піпеткою наносять на середину чистого, але не знежи-реного покрівного скельця. Предметне скло з лункою, краї якої попередньо зма-щують вазеліном, обережно накладають на покрівне скельце, слідкуючи, щоб крап-ля культури знаходилась в центрі заглиблини, і швидко перевертають його. Крапля повинна звисати в лунці, але не торкатись її дна. Звідси походить назва препарату висяча крапля. Змащування країв лунки вазеліном створює своєрідну герметичну вологу камеру. Така крапля не висихає і придатна для спостереження протягом довгого часу (рис. 14). Мікроскопічне дослідження живих об’єктів як в надавленій, так і висячій краплях проводиться за допомогою сильних сухих або імерсійних систем при опу-щеному конденсорі, звуженій діафрагмі та освітленні плоским дзеркалом. Спо-чатку при малому збільшенні (×8) знаходять край краплі, чітко видимий як лінія в дещо затемненому полі зору. По один бік цього краю є багато дрібнесеньких крап-линок конденсату, які осіли на внутрішній поверхні покрівного скельця. По дру-гий бік лінії видно рівномірний сіруватий фон. Це й є крапля. Знайдений край краплі переміщують у центр поля зору мікроскопа й переходять на сильніший сухий (×40), а при потребі й на імерсійний об’єктив (×90). Трохи відкривають діафрагму конденсора й починають спостерігати характер руху. Рухливі бактерії проходять з однаковою швидкістю значну віддаль, часом через усе поле зору, роб-лячи кругові та гвинтові рухи. Найбільш швидкі й прямолінійні рухи роблять мо-нотрихи й лофотрихи. Перитрихам і амфітрихам властива менш енергійна й без-ладна рухливість. Мікроскопіст-початківець може помилково прийняти молеку-лярний (броунівський) рух за справжній. При цьому нерухливі бактерії постійно коливаються між двома близькими точками, ніби “танцюють” на місці.
Одним із суттєвих недоліків методу висячої краплі є слабка чіткість контурів мікробів через кривизну лунки. Для усу-нення цього недоліку можна користува-тись камерою Беттхера. Її легко виготови-ти в будь-якій лабораторії. До звичайного предметного скла за допомогою воску, парафіну або відповідного клею при-кріплюють скляне або пластмасове кільце з діаметром отвору біля 10 мм і висотою 6-7 мм. Верхній край приклеєного кільця змащують вазеліном і на нього наклада-ють покрівне скельце з живими бактерія- Частина І. Загальна мікробіологія ми в краплі, що звисає донизу в цій вологій камері. За допомогою такої камери можна навіть проводити цейтраферну кінозйомку живих об’єктів. Для збільшення контрастності досліджуваних об’єктів в надавленій чи ви-сячій краплях можна застосувати прижиттєве (вітальне) забарвлення. Для цього використовують малотоксичні й майже нешкідливі барвники: метиленовий і то-луїдиновий синій, конго і нейтральний червоний, акридиновий оранжевий, янус зелений та ін. Суспензію мікробів вносять у краплю 0,001 % водного розчину барвника, готують надавлену або висячу краплю і мікроскопують. Можна проводити прижиттєве забарвлення бактерій і флуорохромами. То д і дослідження проводять за допомогою люмінесцентної мікроскопії. Ще кращі можливості для довготривалого вивчення живих мікроорганізмів створюються у спеціально сконструйованих камерах. Найбільш відомі з них зап-ропонували Пєшков і Фонбрюн. Ш-подібна камера Пєшкова. На предметне скло наливають шар розтопле-ного агару товщиною 0,2 мм. Після застигання стерильним скальпелем вирізають дві канавки і отримують Ш-подібний шар середовища. Посів мікробів проводять методом стікаючої краплі лише на середню смужку агару і негайно закривають стерильним покрівним скельцем. Середовище, що виступає за межі покрівного скла, обрізають і розтопленим парафіном герметично закривають краї препарату. Смужка агару, що межує з боків із повітрям канавок, гарантує нормальний розви-ток аеробних і факультативно анаеробних мікробів. Масляна камера Фонбрюна. На предметному склі товщиною 0,5 мм за до-помогою густого спиртового розчину Шеллака приклеюють дві вузенькі скляні смужки такої ж товщини на відстані 10 мм одна від одної. Покрівне скельце з тонким шаром засіяного мікробами агару накладають на скляні бортики поперед-ньо змазані сумішшю воску й каніфолю. Гумовою грушею продувають камеру, щоб випарувати конденсаційну вологу, і пастерівською піпеткою негайно заливають її вазеліновим маслом, обережно підпускаючи його під покрівне скельце. Масло заливають доти, поки весь шар агару знизу буде ним покритий. Краплю масла не слід доводити до країв камери, необхідно завжди залишати невеличкий зазор. За допомогою камер Пєшкова й Фонбрюна можна вивчати найтонші зміни клітинних структур при розмноженні бактерій і проводити їх цейтраферну кінозйом-ку особливо при використанні фазово-контрастної й аноптральної мікроскопії. Макроскопічне виявлення рухливості бактерій. Окрім забарвлення джгу-тиків, дослідження за допомогою надавленої та висячої крапель, рухливість мікро-організмів можна досить просто встановити й неозброєним оком. Для цього дос-ліджувану культуру сіють уколом у стовпчик напіврідкого живильного середови-ща. Посів інкубують у термостаті протягом 18-20 год. Якщо бактерії не мають джгутиків, їх ріст (інтенсивне помутніння) буде тільки впродовж лінії уколу. Рух-ливі бактерії дадуть дифузний ріст по всій товщині живильного середовища. Розділ 4. Фізіологія бактерій Розділ 4 Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1206 | Нарушение авторских прав |
