АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Виготовлення барвників для фарбування за методом Нейссера

Оцтово-кислий метиленовий синій за Нейссером
Метиленовий синій 0,1 г

Етанол 96° 2 мл

Льодяна оцтова кислота 5 мл

Дистильована вода 100 мл

Везувін 12 г

Етанол 96° 60 мл

Дистильована вода 40 мл

Хризоїдин 1 г

Дистильована вода 150 мл

Барвник розчиняють у киплячій воді.

Метод П ’ ю. Готують спеціальний барвник: до 2 мл етанолу добавляють 0,2 г толуїдинового синього, потім 100 мл 5 % розчину оцтової кислоти. Барвник стійкий, зберігається довго. На фіксований мазок наливають приготовлений барвник і підігрівають до появи парів протягом 1-2 хв, охолоджують, промивають водою, висушують і мікроскопують. Волютинові зерна мають темно-синє забарвлення. Метахромазія особливо чітко виступає при штучному освітленні.

Метод Мейера. Окрім метахромазії, забарвлений волютин має ще й значну кислотостійкість. Саме ця властивість і лежить в основі методу. З досліджуваного матеріалу роблять два тонких мазки (подібно до мазків крові), фіксують їх на по-лум’ї (або в рідині Карнуа) і забарвлюють метиленовим синім протягом 10 хв. Один мазок занурюють на 5 хв у 1 % водний розчин сірчаної кислоти, другий – на такий же час у 4 % розчин калію карбонату. Обидва мазки, не промиваючи водою, висушують фільтрувальним папером. Перший препарат помічають літерою К (кис-лота), другий – Л (луг). Мазок К додатково забарвлюють хризоїдином (або 0,25 % розчином світлого зеленого). Цитоплазма бактерій у мазку К забарвлюється у світло-коричневий (або зелений) колір, волютинові зерна – у вишнево-червоний. У мазку Л цитоплазма виглядає слабо забарвленою, а на місці метахроматичних зерен видні пустоти (знебарвлений волютин).

Метод Мейера дає найвірогіднішу можливість встановити волютинову при-роду включень.

Частина І. Загальна мікробіологія

Метод Раскіної. Барвник готують за таким прописом: фенолового фуксину Циля – 4 мл, льодяної оцтової кислоти – 5 мл, етанолу 96° – 95 мл, дистильованої води – до 200 мл. Його наливають на фіксований жаром препарат, підігрівають на полум’ї газового пальника до повного випаровування барвника, промивають во-дою, висушують і мікроскопують. Цитоплазма бактерій забарвлюється в світло-червоний колір, а зерна волютину – в чорно-синій.

Оболонка бактерій складається з цитоплазматичної мембрани, клітинної стінки й капсули.

Цитоплазматична мембрана – м’яка, пластична, тришарова поліфункціо-нальна структура. Вона здатна утворювати інвагінати, які називаються мезосома-ми, і відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини.

Клітинна стінка – своєрідний захисний шар, який визначає і зберігає пос-тійну форму бактерій, захищає цитоплазму від дії механічних та осмотичних сил і виконує ряд інших важливих функцій, є унікальним структурним компонентом, властивим тільки бактеріям (окрім мікоплазм). Морфологічно стінка складається з двох шарів: зовнішнього – пластичного і внутрішнього – ригідного, пружного.

Зовні мікробні клітини можуть бути вкриті речовиною слизового характеру, яку називають капсулою. У бактерій розрізняють мікрокапсулу, капсулу й слизо-вий шар. Мікрокапсула складається з мукополісахаридних фібрил, які невидимі під світловим мікроскопом, а виявляються лише при електронній мікроскопії.

Капсул а – це міцно зв’язаний з клітинною стінкою особливий слизовий шар. Одні бактерії утворюють капсули тільки в організмі людей і тварин (збудники сибірки, чуми, крупозної пневмонії), в інших – вона завжди є в усіх середовищах (клебсієли). Інколи капсула оточує разом декілька клітин (сибіркова бацила, лей-коносток), тоді такі структури називають зооглеями. Окремі види мікробів виді-ляють слизові екзополімери у великій кількості, вони неміцно зв’язані з клітин-ною стінкою, утворюючи рихлий слизовий шар.

При повсякденних діагностичних лабораторних дослідженнях потреба вияв-ляти клітинну стінку чи цитоплазматичну мембрану майже не виникає. Під світло-вим мікроскопом ці структури можна виявити за допомогою явищ плазмолізу або плазмоптизу. Якщо бактерії помістити в гіпертонічний розчин, виникає їх сильне зневоднення, цитоплазма клітин зморщується й відстає від клітинної стінки (плаз-моліз). Під мікроскопом видно контури бактерій, тобто їх клітинні стінки. Якщо ж помістити мікроби в дистильовану воду (або гіпотонічний розчин), спостері-гається протилежне явище – плазмоптиз. Вода направляється в клітину, яка зго-дом набрякає й лопається. При мікроскопії таких клітин спостерігають лише їх контури (чохли).

Розроблені також методи спеціального забарвлення клітинної стінки. Найбільш відомими з них є методи Пєшкова, Гутштейна, Кнайзі.

Метод Пєшкова. Мазок спочатку обробляють спеціальним фіксатором (60 мл 90 % етанолу, 30 мл хлороформу і 10 мл оцтової кислоти) протягом 15 хв, потім протравлюють у 10 % розчині таніну 5 хв, промивають водою і забарвлю-ють водним розчином основного фуксину протягом 30-60 с. Препарат висушують

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

на повітрі й мікроскопують. Оболонка виглядає як тонкий червоний обідок навко-ло бактерійної клітини.

Надійний спосіб забарвлення клітинної стінки, як варіант методу Гутш-тейна, описав Сінай. Препарат фіксують рідиною Карнуа, протравлюють 2-5 хв 10 % розчином таніну, промивають водою і розглядають в надавленій краплі 0,02 % водного розчину кристалічного фіолетового. Забарвлюються оболонки в фіолето-вий колір вже через 5-10 с.

Метод Кнайзі. Зафіксований у полум’ї пальника мазок протравлюють у спеці-а льному розчині (насичений в одний розчин калійних га лунів – 70 мл, 20 % розчин таніну – 30 мл), промивають водою, наносять краплю фенолового фуксину, на-кривають покрівним скельцем і розглядають під мікроскопом. Клітинна стінка фарбується в червоний колір.

Забарвлення капсул. Капсули бактерій містять складні гетерополісахариди і поліпептиди, мають гелеподібну консистенцію. При звичайних методах фарбування вони погано сприймають барвники. Лише у препаратах-відбитках з уражених тканин і органів, мазках із гною, харкотиння вони виявля-ються при будь-якому методі фарбування у вигляді незабарвлених зон (ореолів) між забарвленими тіла-ми бактерій і субстратом (рис. 13). Для фарбування самих капсул запропоновані різні методи.

Спосіб Ребігера. Нефіксований мазок забарв-люють насиченим розчином генціанового фіолето-вого у 40% формаліні протягом 15-20 с, швидко промивають водою і висушують. Капсули фарбуються у червоний, а бактерії – в темно-фіолетовий колір.

Метод Гінса. З досліджуваного матеріалу роблять негативний препарат за способом Буррі. Мазок фіксують сумішшю Никифорова, або метанолом, промива-ють водою і забарвлюють 3-5 хв за Гінсом феноловим фуксином Циля, розведеним 1:3. Промивають водою, висушують, мікроскопують під імерсійним об’єктивом. На темному димчасто-сірому фоні контрастно виділяються незабарвлені капсули, все-редині яких знаходяться яскраво-червоні тіла бактерій (див. вкл., рис. 5).

Метод Гісса. Тонкий мазок фіксують у спирт-формолі або суміші Никифорова (але не жаром), фарбують розчином основного фуксину (1 ч насиченого спиртового розчину барвника + 19 ч дистильованої води) з підігріванням до появи парів, потім залишають на 30 с для охолодження. Препарат промивають великою кількістю розчину мідного купоросу, висушують, не промиваючи водою, і мікроскопують. Капсули забарвлюються в голубий колір, тіла мікробів – у темно-червоний.

Метод Романовського-Гімзи. На мазок, фіксований метанолом або сумішшю Никифорова, наносять розведений барвник Гімзи (2 краплі на 1 мл дистильованої води), фарбують 20-30 хв, швидко змивають водою, висушують і мікроскопують. Бактерії забарвлюються в синій колір, капсули – у блідо-рожевий. Метод постійно дає хороші результати. Інші способи забарвлення капсул менш демонстративні.

Частина І. Загальна мікробіологія

Забарвлення спор. Деякі бактерії при несприятливих умовах здатні утворю-вати ендоспори. При дослідженні незабарвлених мазків із старих агарових куль-тур спори виявляються у вигляді круглих, або овальних утворень, які сильно за-ломлюють світло, і виглядають пустотами. Вони погано забарвлюються аніліно-вими барвниками при звичайних методах фарбування.

Розміри спор можуть не перебільшувати діаметр мікробної клітини (Bacillus) або бути більшими за нього (Clostridium). Спори в клітині можуть розміщуватись центрально (збудник сибірки), субтермінально (палички ботулізму, газової ганг-рени) або термінально (палички правця).

Для виявлення спор розроблені спеціальні методи їх забарвлення. Всі вони основані на дії протрав, які розрихлюють міцні оболонки спор і полегшують про-никнення барвників.

Метод Ожешки. На приготовлений густий незафіксований мазок споронос-ної культури бактерій наливають 0,5 % розчин соляної кислоти й підігрівають 3-4 рази до появи парів (протрава). Препарат промивають водою, висушують фільтру-вальним папером і фіксують у полум’ї пальника. Потім мазок забарвлюють за методом Циля-Нільсена, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в голубий колір, спори – в червоний (див. вкл., рис. 6).

Метод Пешкова – простий і надійний спосіб забарвлення спор, який не ви-магає хімічних протрав і диференціювання в кислоті чи спирті. Його проводять за таким алгоритмом:

1. Виготовляють мазок, висушують і фіксують у полум’ї газового ріжка, або в спиртовому формаліні.

2. На препарат наливають лужний метиленовий синій і доводять його до ки-піння, періодично вносячи в полум’я на 15-30 с.

3. Барвник змивають водою і додатково фарбують 0,5 % водним розчином нейтрального червоного впродовж 30-40 с. Промивають дистильованою водою, висушують, розглядають за допомогою масляної імерсії. Спори виглядають сині-ми, або голубими, цитоплазма – рожевою.

Метод Мюллера. На зафіксований в полум’ї мазок наливають 5 % водний розчин хромової кислоти на 2-3 хв, промивають водою, висушують і забарвлюють за методом Циля-Нільсена, мікроскопують. Спори набувають червоного кольору, а цитоплазма бактерій – синього.

Метод Шеффера-Фултона. Густий мазок фіксують у полум’ї, наливають 5 % водний розчин малахітового зеленого, 3-4 рази нагрівають до появи парів, промивають струменем проточної води 30-40 с і додатково забарвлюють 0,5 % водним розчином сафраніну, промивають водою і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в червоний, а спори – в зелений колір.

Забарвлення джгутиків. У деяких видів плаваючих бактерій є спеціальні органи руху – джгутики, розміри яких досягають 0,02-0,04 мкм у ширину і 6-80 мкм у довжину. Вони містять особливий скоротливий білок флагелін. За кількістю і розташуванням джгутиків рухливі бактерії поділяють на 4 групи:

1. Монотрихи – один полярно розташований джгутик (холерний вібріон);

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

2. Лофотрихи – пучок джгутиків на одному кінці (псевдомонади);

3. Амфітрихи – поодинокі або пучки джгутиків на обох кінцях бактерій (спірили);

4. Перитрихи – багато джгутиків, розташованих навколо клітини (збудник черевного тифу, кишкова паличка).

Число, спосіб розміщення і розміри джгутиків є постійними ознаками для певного виду бактерій, що враховують при проведенні їх систематики.

Виявити джгутики можна за допомогою прямих та непрямих методів. При прямих методах джгутики забарвлюють барвниками або солями металів. Обов’яз-ков о вживають протрави, які сприяють осіданню на джгутиках препаратів срібла або заліза, що призводить до штучного збільшення їх діаметра. Вони стають ви-димими під світловим мікроскопом. До прямих методів виявлення джгутиків відно-сяться і дослідження їх під електронним мікроскопом на ультратонких зрізах.

При непрямих методах спостерігають за рухом бактерій у висячій або надав-леній краплі за допомогою світлової, темнопольної, фазово-контрастної та анопт-ральної мікроскопії.

Забарвлення джгутиків – одна з найтонших, складних і вимогливих бактеріоско-пічних методик. Запропоновано багато складних методів їх фарбування: Леффлера, Грея, Морозова, Уварова, Бенін’єтті та ін. Найнадійнішим із них є метод Леффлера.

Метод Леффлера. Важливою умовою для успішного забарвлення є виготов-лення мазків із молодої (12-18 год) агарової культури на ідеально чистих і знежи-рених скельцях. Бактеріологічною петлею беруть невелику кількість культури і вносять її в 5-6 мл водопровідної води, не емульгуючи, а залишаючи петлю до тих пір, поки бактерії самі розійдуться в рідині. Пастерівською піпеткою з тонко відтяг-нутим капіляром наносять на скельце 5-6 окремих крапель суспензії бактерій у воді, висушують на повітрі. Фіксують дуже обережно, один раз швидко провівши препарат через полум’я.

Для забарвлення необхідно приготувати такі розчини:

1. Протрава: 1 мл насиченого спиртового розчину основного фуксину, 10 мл 20 % водного розчину таніну, 5,5 мл насиченого на холоді водного розчину сірча-нокислого закисного аміачного заліза. Розчин готують за 1-2 доби до вживання, перед використанням обов’язково фільтрують.

2. Концентрований феноловий фуксин Циля, наполовину розведений водою і профільтрований.

На фіксований препарат наносять надлишок протрави й залишають її протя-гом 10-15 хв, промивають дистильованою водою до повного видалення протрави. Фарбують профільтрованим фуксином Циля протягом 3-5 хв, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в темний червоно-ко-ричневий колір, джгутики виглядають світлішими, такого ж відтінку.

Метод Бенін ’ єтті. Суспензію бактерій і мазок роблять так само, як і за методом Леффлера. Протраву і забарвлення проводять одним фарбуючим розчи-ном, який завжди готують ex tempore: розчин 1 – сірчанокислого цинку 1 г, таніну 10 г, дистильованої води 100 мл; розчин 2 – насичений спиртовий розчин генціана фіолетового.

Частина І. Загальна мікробіологія

Змішують 5 мл першого і 3 мл другого розчинів. Суміш наносять на препа-рат-мазок, тричі нагрівають до появи парів, охолоджують, добре промивають во-дою. Висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в темно-фіолетовий колір, джгутики мають більш ніжне забарвлення.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1365 | Нарушение авторских прав