 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Імуноферментні методи (ІФА)В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і анти-тіла з ко н ’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші. Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім пероксидази хрону може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людсь-ких тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при використанні технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів. Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулю-ючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в діаг-ностиці інфекційних хвороб. Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи. Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міче-ним пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н2О2, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста, проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з інши-ми методами. Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утво-рюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять про-тиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплек-сом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсор-бованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення (рис. 56). Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань
промивка промивка
ww 1234 5 Рис. 56. Схема імуноферментного методу: 1 – тверда фаза з фіксованим антигеном; 2 – немічене антитіло, зв’язане з антигеном; 3 – антиглобулін, кон’югований з ензимом, зв’язаний з комплексом антиген-антитіло; 4 – внесення субстрату; який розкладається ензимом; 5 – зміна забарвлення в лунці свідчить про присутність ензиму, а значить, відповідно антитіла. Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші анти-тіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші спрямовані проти гаптена, кон’юговані з пероксидазою. Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості сис-теми авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінан-ти, які зв’язують вітамін біотин. То м у авідин, як і біотин, можна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн або лектин). Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях почали за-стосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх використання може бути двоетапною, ко л и вживаються біотиновані перші антитіла. Біотинована пе-роксидаза і авідин після змішування утворюють комплекси. Для цього методу вже розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази. Техніка подвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні анти-тіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точні-шої характеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпо-пуляцій лімфоцитів. На клітинах одночасно можна виявити два або більше різних антигенів, за якими вони відрізняються між собою. Для подвійної мітки використовують методику з’єднання авідин-біотин-пер-оксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне моноклональне анти-тіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при цьому утворюєть-ся продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі забарвлення з іншим моноклональним антитілом, яке зв’язане з комплексом авідин-біотин-пероксида-за, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох випадках в якості іншого антитіла використовують кінські протимишачі антитіла. Твердофазні імуноферментні методи. Принцип цих методів полягає в на-ступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджувану сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають субстрат Частина ІІ. Імунологія для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично. Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчас-тіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики спе-цифічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є моди-фікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл. Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердо-му носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сиро-ватки зв’язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні анти-тіла, мічені ферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном, мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних ан-титіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном, фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостері-гається висока активність ензиму. Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1053 | Нарушение авторских прав |
