АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Туберкульоз. Туберкульоз –первинно-хронічна інфекційна хвороба людей і тварин, яку викликають патогенні мікобактерії

Туберкульоз – первинно-хронічна інфекційна хвороба людей і тварин, яку викликають патогенні мікобактерії. Залежно від локалізації уражень виділяють туберкульоз легень, шкіри, лімфатичних вузлів, мозкових оболонок, кісток і сугло-бів, органів сечостатевої системи і черевної порожнини. Для сучасного періоду характерне збільшення захворюваності, тяжкий перебіг, підвищення смертності і поява значної кількості штамів, резистентних до багатьох протитуберкульозних препаратів.

В Україні туберкульоз у людини найчастіше викликають Mycobaсterium tuberculosis і M. bovis. Дуже рідко це захворювання спричиняє M. avium. В країнах Африки, Америки та інших континентів подібні до туберкульозу захворювання викликають M. africanum, M. asiaticum, M. kаnsasii, M. fortuitum, M. ulcerans та ін. Ці хвороби називають мікобактеріозами. Ще один представник із роду мікобак-терій – M. lepraе – є збудником прокази. Всього нараховують понад 40 видів міко-бактерій, 24 з них є патогенними і потенційно патогенними.

Лабораторна діагностика туберкульозу і мікобактеріозів включає проведен-ня мікроскопічних, бактеріологічних, біологічних, серологічних досліджень і по-становки алергічних проб. Основним методом є виділення чистої культури збуд-ника, його ідентифікації та визначення чутливості до протимікробних препаратів.

Взяття матеріалу для дослідження. Патологічним матеріалом служать харкотиння, слиз із задньої стінки глотки, плевральний ексудат, гній, спинномоз-кова рідина, промивні води бронхів і шлунка, сеча, випорожнення, пунктати, рідше кров та ін. Хворий збирає харкотиння в баночку або кишенькову плювальницю. Кращі результати отримують при дослідженні харкотиння, зібраного протягом 12-24 год. Інші матеріали збирають у стерильні банки або пробірки. На них наклею-ють етикетку з прізвищем та ініціалами хворого, групу диспансерного обліку, мету дослідження і направляють до лабораторії. Зібраний клінічний матеріал вважа-ють потенційно патогенним.

Бактеріоскопічний метод. Безпосередньо з харкотиння або осаду, який отри-мують після центрифугування гомогенізованого матеріалу, виготовляють мазки. Харкотиння переносять у чашку Петрі, розташовану на темному фоні. За допомо-гою пінцета вибирають слизово-гнійні жмуточки, переносять їх на середину пред-метного скла, накривають другим предметним склом і розтирають матеріал між скельцями. Так само готують мазки з гною та пунктатів. Спинномозкову рідину відстоюють протягом 18-20 год у холодильнику і утворену ніжну сіточку фібрину обережно розправляють на предметному склі. Сечу центрифугують і мазки виго-товляють з осаду. Саме ці мазки знебарвлюють не лише кислотою, а й спиртом для диференціації туберкульозних бактерій від M. smegmatis, яка може знаходи-тися у сечі здорових людей.

Висушені мазки фіксують сухим жаром, забарвлюють за методом Ціля-Нільсе-на або аурамін-родаміном чи іншим флуорохромом. У препаратах, зафарбованих за Цілем-Нільсеном, збудник туберкульозу має вигляд тонких суцільних паличок

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань 273

рубіново-червоного кольору, що розташовані поодинці або групками переважно поза клітинами (див. вкл., рис. 2).

Аурамін-родаміном мазки фарбують протягом 15 хв із підігріванням, потім промивають водою, на 30 с занурюють у солянокислий спирт і знову ретельно промивають водою. Якщо при мікроскопії фон мазка має сильну флуоресценцію, потрібно дещо погасити її 0,25 % водним розчином метиленового синього, промити водою, висушити і досліджувати під люмінесцентним мікроскопом. Туберкульоз-ні палички світяться золотавим світлом на темно-зеленому фоні. Як флуорохроми використовують також аурамін, акридиновий оранжевий та ін. Для виявлення L-форм мікобактерій застосовують переважно фазово-контрастну мікроскопію.

Позитивну відповідь дають при виявленні туберкульозних паличок у мазку після перегляду не менше 100 полів зору, обов’язково вказуючи кількість бактерій у кожному полі зору. Негативний результат мікроскопії не дає права виключити діагноз туберкульозу.

Суттєвим недоліком бактеріоскопічного методу є невисока чутливість: міко-бактерії можна виявити в мазку лише при наявності 50-100 тис. мікробних тіл в 1 мл патологічного матеріалу. Окрім того, за цим методом неможливо відрізнити збудника туберкульозу від інших мікобактерій та визначити його чутливість до хіміопрепаратів. Для підвищення частоти знаходження мікобактерій туберкульо-зу в досліджуваному матеріалі (особливо в харкотинні) застосовують методи зба-гачення – гомогенізації та флотації.

Метод гомогенізації. Добову порцію харкотиння вносять у флакон, добавля-ють рівний об’єм 1 % розчину NaOH, щільно закривають гумовою пробкою і стру-шують у шюттель-апараті 10-15 хв до повного розрідження. Гомогенізовану ріди-ну центрифугують, декантат зливають у розчин хлораміну, осад нейтралізують 2-3 краплями 10 % розчину соляної або 30 % оцтової кислоти. З осаду готують мазки, забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують.

Метод флотації. Порцію харкотиння (10-15 мл) гомогенізують, як вище опи-сано. Колбочку або флакон із розрідженим матеріалом ставлять на водяну баню при 55 °С на 30 хв, потім добавляють 0,5-1 мл ксилолу (бензолу, бензину, толуолу), струшують 10 хв і відстоюють півгодини. Ксилол разом з адсорбованими мікобак-теріями спливає на поверхню і утворює вершкоподібний шар. Доливають дисти-льовану воду, щоб цей шар піднявся у горлечко колбочки чи флакона. Стерильною пастерівською піпеткою частину ксилолового шару переносять на предметне скло, яке нагрівають на скляній пластинці, що лежить на водяній бані при температурі 60 °С. Висушений мазок покривають новою порцією з вершкоподібного матеріа-лу, знову висушують і так повторюють до тих пір, поки весь флотаційний шар перенесуть на мазок. Препарат промивають ефіром, висушують, фіксують сухим жаром, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують. Методи гомогенізації та флотації на 10 % підвищують знаходження мікобактерій туберкульозу в дослі-джуваному матеріалі. При цьому їх вдається виявити, якщо в 1 мл харкотиння знаходиться більше тисячі мікробних тіл.

Промивні води бронхів і шлунка також можна досліджувати за допомогою гомогенізації або флотації.

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Бактеріологічний метод діагностики значно ефективніший, ніж бактеріо-скопічний. Він дає змогу виявити в 1 мл досліджуваного матеріалу 20-100 і більше мікобактерій. Його використовують не лише для постановки діагнозу хвороби, а й для контролю ефективності хіміотерапії, визначення вірулентності і стійкості міко-бактерій до антибіотиків та інших протитуберкульозних препаратів, виявлення змінених варіантів, особливо L-форм.

Майже всі досліджувані матеріали від хворих на туберкульоз (окрім крові, спинномозкової рідини) містять супутню мікрофлору. Тому виділити чисту куль-туру мікобактерій без попередньої їх обробки неможливо. Для знищення сторонніх мікроорганізмів харкотиння, гній, промивні води та інші матеріали обробляють 20 хв при кімнатній температурі подвійним об’ємом 6 % розчину сірчаної кисло-ти або 10 % розчином тринатрійфосфату при 37 °С протягом 18-20 год. Потім оброблений матеріал центрифугують, рідку частину зливають, а осад нейтралізу-ють, добавляючи 1-2 краплі 3 % розчину NaOH, або трикратно відмивають від кислоти ізотонічним розчином хлориду натрію.

Після нейтралізації матеріал засівають у 3-6 пробірок із щільним середови-щем Левенштейна-Йенсена (картопляний крохмаль з гліцерином, солями, яєчною суспензією і малахітовим зеленим) та Фінна-2, яке має такий же склад, як і попе-реднє, але в ньому аспарагін замінено на глютамінат натрію. Ці середовища реко-мендовані ВООЗ як стандартні в усіх країнах світу для первинного вирощування мікобактерій туберкульозу та визначення їх стійкості до хіміопрепаратів. Для інших потреб можна також використовувати гліцериновий бульйон, середовище Петра-ньяні, Павловського, Сотона.

Спинномозкову рідину, ексудат, кров, пунктат вносять піпеткою на живильне середовище без попередньої їх обробки. Всі ватні пробки зрізають на рівні вінця пробірки, проштовхують всередину на 1-1,5 см і заливають розтопленим пара-фіном для попередження висихання середовища.

Засіяні пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 3-4 тижнів. Ті пробірки з середовищами, на які матеріали сіяли петлею і втирали в поверхню агару, розміщують вертикально. Якщо посіви робили пастерівською піпеткою, пробірки вміщують у термостаті в похилому положенні на 2-3 доби, потім верти-кально. Посіви проглядають кожні 5-7 днів. Всі пробірки з раннім ростом сторон-ньої мікрофлори вилучають. У випадках раннього росту характерних колоній (до 5-го дня) роблять висновок про наявність швидкоростущих мікобактерій, тобто негативну відповідь щодо туберкульозу.

Ріст туберкульозних бактерій частіше всього появляється через 3 тижні, але бувають випадки й через 2-3 місяці. На щільних середовищах виростають грубі, шорсткі, сухі, безпігментні колонії, що мають зморщену поверхню, потовщений центр і тонкі, нерівні краї. За зовнішнім виглядом вони нагадують дольки цвітної капусти або бородавки.

Це типові R-форми колоній, властиві патогенним штамам. S-форма колоній жовтого або оранжевого кольору, як правило, характерна для інших видів міко-бактерій. Але під впливом антибактеріальних препаратів M. tuberculosis також

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань 275

може утворювати м’які, вологі, пігментовані S-форми колоній. Необхідно відмічати швидкість і рясність росту.

Значно рідше досліджуваний матеріал сіють на гліцериновий бульйон, рідкі середовища з плазмою крові, бичачою сироваткою або синтетичне середовище Сотона. На них мікобактерії туберкульозу ростуть дещо швидше, мають вигляд ніжної плівки, яка з часом потовщується, грубішає, стає крихкою і випадає в осад. Із рідких середовищ роблять висів у пробірки із щільним середовищем, що збільшує число позитивних результатів, але дослідження триває довше.

Щоб підвищити частоту висівання збудника туберкульозу, досліджуваний матеріал обробляють детергентами, які мають бактерицидну дію на іншу мікро-флору (лауросепт, лаурисульфат натрію, родолан, теапол, цетавлон тощо). При цьому покращується гомогенізація матеріалу, виключається центрифугування, швидше виростають колонії.

Прискорені методи к ультивування. Щоб значно швидше отримати ріст міко-бактерій туберкульозу, запропоновані методи мікрокультур Прайса і Школьнікової. Метод Прайса полягає в тому, що харкотиння, гній, осад сечі, промивні води та інший матеріал наносять товстим шаром на декілька вузьких предметних скелець (звичайні скельця розрізають навпіл по довжині). Висушені мазки беруть стериль-ним пінцетом і занурюють на 15-20 хв у пробірки з 2 % розчином сірчаної кисло-ти, а потім тричі промивають стерильним розчином хлориду натрію для видален-ня кислоти. Після цього препарат вміщують у пробірки або флакони з рідким сере-довищем Сотона або цитратною кров’ю. Мазок повинен повністю покриватись живильним середовищем. Для пригнічення сторонньої мікрофлори, яка може інколи залишатись після обробки мазків кислотою, в середовище добавляють 10 ОД/мл пеніциліну. Посіви вирощують у термостаті при 37-38 °С. Через 3-4 доби скельця з мазками виймають, фіксують сухим жаром, забарвлюють за Цілем-Нільсеном або родаміном і мікроскопують. Вірулентні мікрокультури в препара-тах утворюють джгути або “коси”, що формуються під впливом корд-фактора. Максимальний ріст мікрокультур відмічається на 7-10 день (див. вкл., рис. 21).

Глибинне культивування мікобактерій у гемолізованій крові за методом Школь-нікової отримують шляхом посіву матеріалу, обробленого, як звичайно, сірчаною кислотою і промитого 0,85 % розчином хлориду натрію. Через 6-8 днів вирощу-вання культуру центрифугують, з осаду виготовляють мазки, забарвлюють за мето-дом Ціля-Нільсена або флуорохромом і мікроскопують. У препаратах виявляють типові мікрокультури з характерним розташуванням у вигляді кіс і джгутів.

Щоб виявити L-форми мікобактерій туберкульозу, посів матеріалу після відпо-відної обробки кислотою проводять у спеціальне напіврідке середовище, розлите в пробірки у вигляді стовпчика. Вирощують при 37 °С протягом 1-2 міс. Ріст L-форм нагадує хмаринку з дуже дрібними включеннями, що подібні до манної крупи. Виготовлені мазки досліджують під фазово-контрастним мікроскопом, за допо-могою якого найкраще виявляють різноманітні за морфологією L-форми. Їх мож-на виявити і шляхом послідовних пасажів на гвінейських свинках або за допомо-гою імунофлуоресцентного методу з використанням сироваток, що містять мічені антитіла проти антигенів L-форм.

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Для ідентифікації виділених культур збудників туберкульозу і диференціації їх від інших видів мікобактерій використовують багато ознак. Основними з них є вірулентність, швидкість росту, форма колоній, утворення пігменту, каталази, уре-ази, нікотинамідази, нітратредуктази (табл. 58).

Таблиця 58

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 666 | Нарушение авторских прав