АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Стафілококові інфекції

Pід Staphylococcus охоплює кулясті нерухомі аспорогенні грампозитивні фа-культативно-анаеробні бактерії, що належать до родини Micrococcacеae. У визнач-нику бактерій Д.Бергі наведені диференціальні ознаки 29 видів стафілококів. Вони поділяються на дві групи – коагулазопозитивні й коагулазонегативні. До першої групи належать S. aureus, S. intermedius i S. hyicus. Їх роль в інфекційній патології нерівнозначна. Найчастіше різноманітні захворювання у людей і тварин викликає S.aureus, значно рідше – S. hyicus. S. intermedius патогенний тільки для тварин. Впродовж багатьох років коагулазонегативні стафілококи вважали непатогенни-ми. Але тепер ця точка зору змінилася. У зв’язку з погіршенням екологічної ситу-ації в більшості країн та пов’язаним з нею пониженням природного імунітету по-частішали випадки гнійно-септичних уражень тканин і органів, викликаних коа-гулазонегативними видами, які зустрічаються на шкірі та слизових оболонках людини (S. epidermidis, S.auricularis, S.capitis, S.cohnii, S.haemolyticus, S.hominis, S.lentus, S.saprophyticus, S.schleiferi, S.simulans, S.warneri, S.xylosus та ін.).

Серед епідеміологів, мікробіологів і клініцистів досить поширене переконан-ня, що сьогодні непатогенних стафілококів не існує. Все частішають випадки виді-лення з крові, тканин і органів культур стафілококів без будь-яких маркерів патоген-ності. Однак, при елімінації їх з організму зникають всі симптоми захворювання. Все це необхідно враховувати при проведенні лабораторної діагностики стафіло-кокових інфекцій. На жаль, у рутинних бактеріологічних лабораторіях нашої країни поки що можлива ідентифікація лише S.aureus, S.epidermidis i S.saprophyticus.

Стафілококи найчастіше уражають шкіру, її придатки та підшкірну кліткови-ну. Вони викликають фурункули, карбункули, панариції, пароніхії, абсцеси, флег-мони, мастити, лімфаденіти, нагноєння ран, в тому числі й операційних. У дітей стафілококи є збудниками стафілодермій, епідемічних пухирчаток, імпетиго. Їх виділяють при плевритах, бронхітах, пневмоніях, перитонітах. Вони можуть спри-чинити ангіни, тонзиліти, гайморити, отити, ко н ’юнктивіти, дещо рідше – менін-гіти, абсцеси мозку, міокардити, ендокардити, артрити, інфекції судинних про-

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

тезів. Дуже небезпечні харчові токсикоінфекції, ентероколіти, холецистити, цис-тити, пієліти, пієлонефрити. При проникненні в кров або кістковий мозок викли-кають сепсис, остеомієліт, синдром токсичного шоку. Проте всі захворювання ста-філококової етіології не розглядаються як гострозаразні.

Взяття матеріалу для дослідження. При стафілококових інфекціях дослі-джують гній, кров (при сепсисі), виділення слизових оболонок, харкотиння, за-пальний ексудат, ліквор, рановий вміст, плевральний випіт, жовч, сечу. В разі підоз-ри на токсикоінфекцію – блювотні маси, промивні води шлунка, випорожнення, залишки їжі (особливо сир, молоко, тістечка, торти, креми, морозиво та ін.). При санітарно-бактеріологічних контролях досліджують змиви з рук, столів та інших предметів. У бактеріоносіїв матеріал забирають тампоном окремо з глотки та но-сових ходів.

Із відкритих гнійних уражень матеріал беруть стерильним ватним тампоном після видалення ранового нальоту, в якому може бути сапрофітна мікрофлора з повітря, шкіри тощо. При закритих гнояках роблять пункцію шприцом. Слиз із рото- й носоглотки беруть стерильним тампоном. Харкотиння й сечу забирають у стерильні пробірки, банки. Кров (10 мл), взяту із ліктьової вени, й ліквор – при пункції спинномозкового каналу, з дотриманням асептики сіють біля ліжка хво-рого в 100 мл цукрового бульйону. Кров рекомендують швидко (до її згортання) вносити прямо із шприца у флакон з бульйоном, ретельно перемішати, запобігаю-чи утворенню згустка. Проби крові не можна заморожувати. У 25 % випадків при стафілококовому сепсисі кількість бактерій в крові (КУО) може бути менше 1/мл. При підозрі на такий стан необхідно сіяти 25-30 мл крові.

Бактеріоскопічне дослідження. Майже з усіх досліджуваних матеріалів (гній, рановий вміст, ексудат, харкотиння, осад сечі тощо) за допомогою бактеріо-логічної петлі виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і мікроскопують. Лише з крові та змивів мазки не роблять оскільки в них мала кількість мікроорганізмів. У типових випадках стафілококи мають кулясту форму, фіолетовий колір, розта-шовуються несиметричними гронами, але зустрічаються й одинокі клітини, пари або тетради (рис. 60).

Останнім часом у зв’язку з широким викорис-танням антибіотиків морфологія стафілококів зміни-лась і типового їх розташування в мазках із гною часто не спостерігають. У зв’язку з цим відрізнити стафілококи від стрептококів за їх морфологією та взаємним розташуванням часто практично немож-ливо. То м у потрібно робити посів, виділяти чисту культуру та ідентифікувати її.

Але й первинна мікроскопія може дати попе-редню відповідь в разі виявлення типових грампо-зитивних коків правильної круглої форми, розташо-

ваних гронами і при великій кількості бактерій у _{Рис. 60. Стафілокок}

полі зору. Вона також дає змогу вибрати необхідні _{(маз о к із чистої культури).}

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

для посіву елективні середовища, провести пряме визначення чутливості до анти-біотиків мікрофлори гною ще до виділення чистої культури (див. вкл., рис. 9).

Бактеріологічне дослідження. Матеріал від хворих і бактеріоносіїв засівають негайно або не пізніше 3-4 год після взяття при умові зберігання його на холоді.

В перший день петлею, шпателем або безпосередньо тампоном роблять по-сіви на кров’яний агар та елективні для стафілококів середовища (жовтково-со-льовий (ЖСА) або молочно-жовтково-сольовий агар (МЖСА). Чашки з посівами інкубують при 37 °С протягом 48 год, або одну добу в термостаті й додатково 24 год при кімнатній температурі при хорошому освітленні. Якщо в досліджуваному матеріалі бактерій мало (дані мікроскопії) – посів для збагачення роблять ще й у тіогліколеве середовище.

На другий день проводять висів із цукрового бульйону на вказані елективні середовища, досліджують масивність росту й характер колоній після посівів інших матеріалів. На кров’яному агарі стафілококи утворюють непрозорі, злегка опуклі колонії середніх розмірів з гладенькою, блискучою, немовби полірованою поверх-нею, чітко окресленим краєм, маслянистої консистенції. Патогенні штами утво-рюють навколо колоній прозорі зони гемолізу (див. вкл., рис. 8). На елективно-диференціальних середовищах, як правило, виростають лише колонії стафілококів. Зокрема, на жовтково-сольовому агарі вони утворюють колонії із зоною помутніння навколо них і характерним райдужним вінчиком по периферії (лецитовітелазна реакція). На молочно-жовтково-сольовому агарі виявляють наявність пігменту, який може бути золотистим, палевим, білим, жовтуватим, оранжевим та ін.

Із всіх типів колоній виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і мікроско-пують, виявляючи типові грампозитивні стафілококи. Не менше двох типових чи підозрілих щодо стафілококів колоній пересівають на скошений агар. У першу чергу відсівають колонії з гемолізом і ті, що дали позитивну лецитовітелазну ре-акцію. При відсутності таких колоній досліджують не менше двох пігментованих колоній, при мікроскопії яких виявили типові стафілококи. Пробірки з посівами вміщують у термостат при 37 °С на 18-20 год.

В наступні дні проводять ідентифікацію виділених чистих культур, для чого перевіряють їх морфологічні й тинкторіальні властивості (забарвлення за Грамом), плазмокоагулюючу активність та інші властиві для стафілококів тести.

Плазмокоагулазу виявляють шляхом внесення виділеної культури у пробірку з цитратною плазмою кролика. Її можна приготувати в будь-якій лабораторії. У кролика із серця беруть 8 мл крові, вносять у пробірку з 2 мл стерильного 5 % лимонно-кислого натрію і ставлять у холодильник. Після повного осідання форме-них елементів плазму відсмоктують у стерильну пробірку. Вона може зберігатись у холодильнику 8-10 днів. Перед використанням її розводять 1:5 (1 мл плазми і 4 мл ізотонічного розчину хлориду натрію) і розливають в аглютинаційні стерильні пробірки по 0,5 мл. Повну петлю культури стафілококів емульгують у плазмі і вміщують у термостат на 3 год, потім залишають при кімнатній температурі на 18-20 год. Попередній облік згортання плазми проводять через 3 год, остаточний – на другий день. Дуже зручно користуватись стандартною сухою цитратною плаз-

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань 175

мою кроля. Перед вживанням в ампулу додають 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію й після повного розчинення її розводять 1:5. Плазма людини малопридатна для постановки реакції плазмокоагуляції, оскільки в ній можуть бути консерванти, лікарські речовини, антитіла, які можуть пригнічувати утворення плазмокоагулази.

Якщо виділена культура викликає гемоліз, коагулює плазму і дає позитивну лецитовітелазну реакцію, вже на третій день можна видати результат на наявність S.aureus. Якщо ж культура має лише плазмокоагулазу або тільки вітелазну ак-тивність, для остаточного встановлення виду стафілокока потрібно визначити до-даткові критерії патогенності: ферментацію маніту в анаеробних умовах, ДНК-азну активність, продукцію лізоциму, фосфатази, а також визначити чутливість до новобіоцину.

Ферментацію маніту в анаеробних умовах можна визначати, використову-ючи стандартне сухе середовище з манітом й індикатором ВР. Після його виготов-лення й регенерації в пробірки добавляють по 1 мл стерильного вазелінового мас-ла і засівають культуру уколом у стовпчик. Посіви інкубують у термостаті протя-гом 5 діб. При розкладі маніту середовище синіє. Ця проба позитивна у 94-96 % штамів S.aureus.

Визначення ДНК-ази. До сухого живильного агару додають наважку ДНК із розрахунку 2 мг на 1 мл середовища, яке потім стерилізують текучою парою 30 хв. Його можна зберігати в холодильнику протягом 2-х місяців. Перед викорис-танням агар розплавляють, додають хлористий кальцій (0,8 мг на 1 мл). На підсу-шене середовище в одній чашці можна засіяти смужками до 16-20 культур. Після інкубації посівів протягом 18-20 год їх заливають 5 мл 1N HCl. Через 7-10 хв кис-лоту зливають і проводять облік. Соляна кислота, реагуючи з ДНК, утворює не-прозорий білий преципітат. Якщо культура продукує ДНК-азу, остання деполі-меризує ДНК і при додаванні соляної кислоти навколо смужок культур виникає прозора зона, що свідчить про наявність фермента ДНК-ази.

Гіалуронідазну активність визначають, додаючи до 0,5 мл бульйонної куль-тури стафілокока 0,5 мл препарату гіалуронової кислоти з пупочних канатиків. Суміш інкубують 30 хв при 37 °С і 10 хв при 4 °С. У пробірку додають 4 краплі 15 % оцтової кислоти, струшують і через 5 хв роблять облік результатів. Відсутність згустка свідчить про наявність гіалуронідази, наявність згустка – про її відсутність. Для виготовлення гіалуронової кислоти свіжу пуповину новонароджених под-рібнюють, заливають подвійною кількістю дистильованої води. Суміш витриму-ють 24 год у холодильнику, потім нагрівають і кип’ятять до згортання шматочків пуповини. Отриманий гіалуронат фільтрують через ватно-марлевий фільтр і пере-віряють на утворення згустка.

Лізоцимну активність стафілококів визначають за допомогою посіву виді-лених культур у вигляді бляшок на щільний живильний агар, до якого додають густу завись культури Micrococcus luteus. При виділенні лізоциму навколо бля-шок виникають зони лізису (просвітління агару).

Визначення фосфатази проводять засівом культур на живильний агар, до якого заздалегідь додають паранітрофенілфосфат (0,5 мг на 1 мл середовища).

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Інкубація протягом 18-20 год при 37 °С. Поява навколо посівів інтенсивного жов-того забарвлення свідчить про виділення фосфатази.

Стійкість до новобіоцину визначають посівом культури на м’ясо-пептон-ний агар з новобіоцином (1,6 мкг/мл). Золотисті й епідермальні стафілококи чут-ливі до цього антибіотика, а S.saprophyticus – стійкий.

Реакція Фогес-Проскауера. Виділену чисту культуру сіють у глюкозо-фос-фатний бульйон Кларка. Через три дні інкубації при 37 °С до 1 мл культури дода-ють 0,6 мл альфа-нафтолу та 0,2 мл КОН і струшують. При позитивній реакції через 3-5 хв з’являється рожеве забарвлення.

Біологічне дослідження. Патогенні стафілококи, що викликають харчові токсикоінфекції, виділяють та ідентифікують так само, як і стафілококи взагалі. Вони відрізняються здатністю продукувати ентеротоксини А, В, С1, С2, С3, D, Е, F, які характеризуються тер мостабільністю та антигенною специфічністю. Най-частіше зустрічаються типи А і D. Вказані токсини отримують шляхом посіву культури в спеціальне напіврідке середовище, інкубують 3-4 доби при 37 °С в ексикаторах з 20 % СО₂. Середовище з токсином пропускають через мембранні фільтри № 3 і 4. Отриманий фільтрат прогрівають при 100°С 30 хв і вводять коше-нятам-сисунам внутрішньоочеревинно або через зонд у шлунок. Через 30-60 хв у тварин виникає блювання, пізніше пронос і загальна прострація. Щоб виявити ентеротоксини у харчових продуктах, що спричинили токсикоінфекцію, ними го-дують кошенят. Останнім часом ідентифікацію і типування ентеротоксинів про-водять за допомогою реакції імунопреципітації в агаровому гелі. Це найпрості-ший і найчутливіший метод виявлення ентеротоксинів.

Серологічне дослідження при стафілококових інфекціях проводиться лише тоді, коли збудника виділити не вдається, наприклад, при хронічних процесах (ос-теомієліт, септикопіємія) особливо якщо вони довго лікуються антибіотиками. Серед сучасних серологічних реакцій найчастіше використовують РНГА та ІФА, зокрема для визначення антитіл до рибіттейхоєвої кислоти або інших видоспеци-фічних антигенів. Але ідентифікація антитіл до тейхоєвої кислоти вирішального значення не має, а результати часто суперечливі. До того ж, реактиви для їх визна-чення поки що малодоступні.

Дослідження на бактеріоносійство серед медичного персоналу проводиться двічі на рік. При планових бактеріологічних обстеженнях обов’язково досліджують слиз із носа. Дослідження слизу із ротоглотки проводять вибірково, при наявності запальних процесів у зіві. Матеріал беруть із передніх відділів носа стерильним ватним тампоном і ним же сіють на ЖСА не пізніше, як через 2 год після взяття. Виділення та ідентифікацію S.aureus проводять так само, як і при дослідженні інших матеріалів.

При визначенні масивності обсіменіння стафілококами слизової носа там-пон із досліджуваним слизом вносять у пробірку з 0,5 мл стерильного ізотонічно-го розчину хлориду натрію, прополіскують його в рідині струшуванням протягом 10 хв, відтискують об стінки й видаляють. Рідину багаторазово перемішують піпет-кою. Окремо піпеткою наносять 0,1 мл змиву на чашку із ЖСА і ретельно розтира-

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань 177

ють шпателем. Чашки з посівами інкубують при 37 °С протягом 48 год, після чого підраховують кількість колоній. Якщо з 50 колоній S.aureus, що виросли, дві відне-сені до одного й того ж фаготипу, правомірно вважати, що й всі інші колонії, іден-тичні за морфологією та пігментом, належать до S.aureus аналогічного фаготипу.

Приклад для розрахунку: після посіву 0,1 мл змиву виросло 50 колоній S.aureus. Отже, у 0,5 мл буде 50·5 = 250 колоній або 2,5·10².

Масивність стафілококового обсіменіння, яке виражається числом 10² мікроб-них клітин, є помірною, при ній збудник в оточуюче середовище не виділяється. При виділенні >10³ бактерійних клітин рівень обсіменіння визначають як висо-кий, при якому збудник виділяється у зовнішнє середовище не лише при кашлі та чханні, а й при спокійному диханні. За таких обставин треба обов’язково прово-дити санацію бактеріоносіїв.

Визначення фаговарів золотистих стафілококів має важливе значення для встановлення джерела інфекції. Методика фаготипування наводиться в інструкції для використання стафілококових бактеріофагів. Штами S.aureus, виділені із сли-зових оболонок дихальних шляхів медперсоналу хірургічних стаціонарів і поло-гових будинків, треба фаготипувати в обов’язковому порядку, виділені від хво-рих – лише за епідпоказаннями. Для визначення фаговарів використовують міжна-родний набір із 23 помірних фагів, які розділені на 4 групи:

1 група – фаги 29, 52, 52А, 79, 80;

2 група – фаги 3А, 3С, 55, 71;

3 група – фаги 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 84, 85;

4 група – фаги 94, 95, 96; поза групою – фаги 81, 187.

За допомогою вказаних фагів вдається типувати 60-80 % виділених культур. Встановлені особливі епідемічні штами S.aureus, які найчастіше циркулюють у стаціонарі при внутрішньолікарняних інфекціях (напр. фаготипи 77 і 80). Отри-мані також набори специфічних бактеріофагів для типування S.epidermidis.

У чистих культур стафілококів, виділених від хворих, обов’язково визнача-ють антибіотикограми з метою застосування адекватних препаратів для лікуван-ня або інтра- і передопераційної антибіотикопрофілактики. У стафілококових носіїв визначення чутливості культур до антибіотиків проводять лише за показаннями, наприклад, при необхідності вибирати препарат для санації. При цьому викори-стовують дискодифузійний метод або спосіб серійних розведень.

Останнім часом у бактеріологічних лабораторіях широко стали використову-вати СІБ та ПБДС для швидкої та більш економічної уніфікованої ідентифікації бактерій.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1284 | Нарушение авторских прав