АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Дифтерія. Дифтерія – гостра, переважно дитяча інфекційна хвороба, яка проявляється характерним фібринозним запаленням у місці локалізації збудника та сильною

Дифтерія – гостра, переважно дитяча інфекційна хвороба, яка проявляється характерним фібринозним запаленням у місці локалізації збудника та сильною інтоксикацією організму дифтерійним екзотоксином. Збудником її є Coryne-bacterium diphtheriaе, що належить до роду коринебактерій. До цього роду вхо-дить ще біля 20 видів бактерій, патогенних для людей, тварин і рослин. З них найбільше значення для практичної медицини мають наступні:

1. C. ulcerans – може викликати фарингіти, ураження шкіри; її виявляють і в здорових людей, у молочних продуктах і тарі для їх перевезення; деякі штами токсигенні.

2. C. jeikeium (раніше коринебактерії JK) – спричиняє пневмонію, ендокар-дит, перитоніт, інфікує рани, шкіру.

3. C. cistitidis (раніше коринебактерії групи D2) – ініціює утворення камінців у сечовивідних шляхах та пневмонію.

4. C. minutissimum – викликає еритразми, абсцеси легень, ендокардити.

5. C. haemolyticum – може викликати тонзиліти, целюліти, абсцеси мозку, остеомієліти, хронічні дерматити.

6. С. xerosis – раніше вважали збудником ксерозу (хронічного кон’юнктиві-ту), тепер її відносять до сапрофітів.

7. C. pseudodiphtheriticum – сапрофіт, проживає на слизовій оболонці носо-глотки людини.

Взяття і доставка матеріалу до лабораторії. Матеріалом для досліджен-ня є плівка з мигдаликів, дужок, піднебіння, язичка, слиз із зіва та носа, рідше виділення з ока, вуха, рани, піхви, ураженої ділянки шкіри. На вимогу епідеміоло-га досліджують змиви з іграшок та інших предметів, деякі харчові продукти (мо-локо, морозиво тощо). Матеріал потрібно брати до початку етіотропного лікуван-ня натще або через 2 год після прийому їжі.

Для взяття матеріалу використовують тампони, сухі або попередньо змочені 5 % розчином гліцерину, вміщені в пробірку й простерилізовані разом з нею. До-сліджуваний матеріал із ротоглотки і носа беруть двома окремими тампонами, намагаючись взяти його на межі здорової й ураженої ділянки обертальними руха-ми, не торкаючись тампоном слизової щік, зубів та язика, який притискають шпа-телем. При ларингоскопії плівку або слиз беруть безпосередньо з гортані. Плівки та слиз із рота і носа беруть обов’язково в усіх випадках, навіть при дифтерії рідких локалізацій (шкіра, рана, око, вухо, вульва).

Якщо необхідно провести первинну бактеріоскопію на вимогу лікаря, матеріал беруть окремим (додатковим) тампоном або направляють частину знятої плівки, ретельно розтертої між двома предметними скельцями.

Тампони після забору матеріалу вміщують у ті ж самі пробірки, на яких над-писують номер, дату і час відбору, прізвище лікаря. Вони повинні бути доставлені до лабораторії не пізніше 3-х год після взяття матеріалу. Якщо схема забору перед-бачає посів біля ліжка хворого, то пробірки і чашки з посівами негайно направля-

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ють до лабораторії або інкубують при 37 °С і доставляють через 20-23 год, в хо-лодну пору в сумках із грілками.

Бактеріоскопічне дослідження матеріалу від хворого проводять лише на вимогу лікаря і тільки для того, щоб розпізнати некротичну ангіну Симановсько-го-Плаута-Венсана (виявлення веретеноподібних паличок і спірохет Венсана, які при звичайних методах культивування не ростуть).

Впродовж багатьох років мікроскопічне дослідження і виявлення зерен во-лютину, забарвлених за методами Леффлера і Нейссера, було основою лаборатор-ної діагностики дифтерії та виявлення бактеріоносійства. Тепер, у зв’язку з мінли-вістю дифтерійних бактерій під впливом антибіотиків, первинна мікроскопія досліджуваного матеріалу не рекомендується.

Бактеріоскопічне дослідження проводиться з метою ідентифікації нетипо-вих колоній на кров’яно-телуритових середовищах та при перевірці чистоти виді-лених культур. Мазки забарвлюють за Грамом, Леффлером і Нейссером. Можна також фарбувати їх оцтовокислим метиловим фіолетовим, толуїдиновим синім або бентіазоловим і тіазиновим барвниками.

Дифтерійні палички в мазках розташовуються під кутом, у вигляді латинсь-ких літер V, X, Y, або утворюють скупчення, що нагадують купку розкиданих сірників. Волютинові зерна розташовуються, як правило, на полюсах мікробних клітин. (див. вкл., рис. 17 і 18). Псевдодифтерійні бактерії та дифтероїди розмі-щуються паралельно (у вигляді “частоколу”) і, звичайно, не мають зерен волюти-ну. Зерна Бабеша-Ернста можна також виявити за допомогою люмінесцентної мікроскопії при забарвленні мазків корифосфіном. Зерна набувають оранжево-червоного кольору на фоні жовто-зелених тіл бактерійних клітин.

Бактеріологічне дослідження. Клінічний матеріал засівають на кров’яний агар і кров’яно-телуритовий агар (або середовище Клауберга ІІ), розлиті у чашки Петрі. Посів на кров’яний агар необхідний для виявлення й іншої мікрофлори. Крім того, деякі штами C.diphtheriae чутливі до дії телуриту калію, тому їх ріст на телуритових середовищах може пригнічуватись. Для виявлення дифтерійного бак-теріоносійства посіви роблять тільки на кров’яно-телуритовий агар, оскільки в посівному матеріалі може міститись невелика кількість дифтерійних паличок, ріст яких на неселективних середовищах буде пригнічуватись іншою мікрофлорою. При цьому допускається використання і транспортного середовища.

Кров ’ яно-телуриновий агар. До 100 мл 2 % розплавленого й охолодженого до 50 °С живильного агару рН 7,6 добавляють 10-15 мл дефібринованої крові та 2 мл 2 % розчину телуриту калію. Суміш ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі ша-ром, товщиною 3-4 мм.

Середовище Клауберга ІІ. До 100 мл 3 % живильного агару рН 7,6, розплавленого й охолодженого до 50 °С, додають 3 мл 2 % розчину телуриту калію, 10 мл гліцеринової суміші та 50 мл гемолізованої крові. Гліцеринову суміш готують шляхом додавання 20 мл стерильного гліцерину до 40 мл дефібринованої крові. Суміш можна зберігати в холо-дильнику протягом 4-х місяців. Для приготування гемолізованої (“лакової”) крові до 34 мл стерильної дистильованої води додають 16 мл дефібринованої крові.

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань 259

Транспортне напіврідке середовище. До 100 мл перевару Хоттінгера або м’ясо-пеп-тонного бульйону додають 1 г будь-якого комерційного агару, встановлюють рН 7,6, сте-рилізують в автоклаві при 112 °С 30 хв, асептично додають 10 мл сироватки та 1 мл 2 % телуриту калію. Середовище розливають у пробірки по 5 мл. При можливості використову-ють і більш складне транспортне середовище ЕМЕС (AMIES), модифіковане Стюартом.

Посів від одного хворого роблять на одну чашку, використовуючи при цьому одну половину середовища для посіву із ротоглотки (мигдаликів, дужок, язичка), а другу – для посіву іншим тампоном із носа. Якщо є досліджуваний матеріал із шкіри, ока, вуха та інших локалізацій – додають ще одну чашку. Не можна засіва-ти матеріал від кількох хворих на одну чашку. Середовища перед посівом зігріва-ють у термостаті 15-20 хв.

При посіві досліджуваного матеріалу його втирають тампоном спочатку в окрему ділянку кров’яного агару площею 2×1 см, потім аналогічно на кров’яно-телуритовому агарі (або середовищі Клауберга ІІ), при цьому тампон весь час по-вертають, щоб засіяти з нього весь матеріал. Потім тим же тампоном штрихами засівають решту поверхні середовища (половину чашки). Така техніка посіву доз-воляє отримати ізольовані колонії (чисту культуру), які використовують безпосе-редньо з чашки для визначення токсигенності та подальшої їх ідентифікації. Засі-яні чашки або пробірки з транспортним середовищем інкубують у термостаті при 37 °С протягом 20-24 год.

На другий день за допомогою стереоскопічного мікроскопа досліджують ха-рактер колоній. Якщо ріст відсутній на обох середовищах, роблять повторний забір матеріалу.

Чашки з типовими і підозрілими на C.diphtheriae колоніями відбирають для подальшої ідентифікації культури за всіма тестами. Мікроскопію підозрілих ко-лоній можна і не проводити.

Колонії дифтерійних паличок на кров’яному агарі білуватого або жовтуватого кольору, непрозорі, круглої, злегка опуклої форми, діаметром 1-2 мм. Звичайно вони мають маслянисту консистенцію, хоч деякі можуть утворювати крихкі шорсткі R-колонії.

На кров’яно-телуритових середовищах колонії C.diphtheriae через 24 год росту мають сірий колір, опуклі, з рівним краєм, в’язкі. Через 48 год вони набувають темно-сірого або чорного кольору з металевим блиском, рівними або злегка фестон-частими краями, гладенькою або з радіально посмугованою поверхнею (R-фор-ми), в’язкі чи крихкі при дотику петлею.

За структурою 48-годинних колоній на телуритових середовищах і деякими ферментативними ознаками збудника дифтерії поділяють на чотири культураль-но-біохімічних варіанти (біовари) – gravis, mitis, belfanti, intermedius.

Біовар gravis звичайно утворює сірі або чорні матові сухі колонії, крихкі, плоскі, гладенькі, діаметром 1,5-2 мм, із радіально посмугованою поверхнею; він високотоксичний, не викликає гемолізу, розкладає крохмаль і глікоген.

Біовари mitis та belfanti ростуть у вигляді сірих або чорних, круглих гладень-ких опуклих колоній з рівними краями, діаметром 1-1,5 мм; ці варіанти менш ток-сичні, викликають гемоліз, але не розкладають крохмаль і глікоген.

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Біовар intermedius утворює дрібні, сірі, прозорі колонії, діаметром 0,5-1 мм, із плоскою гладенькою поверхнею; він слаботоксичний, не розщеплює крохмалю і глікогену (див. вкл., рис. 19 і 20).

Якщо типовий ріст відсутній, з інших, сумнівних колоній готують мазки. При виявленні в них спорових паличок, коків, дріжджів та ін., дослідження на дифте-рію припиняють і дають негативну відповідь. Проте, важливо пам’ятати, що диф-терійні бактерії, які утворили нетипові колонії на середовищах з інгібіторами росту (телурит калію), можуть бути вкорочені, потовщені, але зберігають поліморфізм та характерне розташування.

При рості типових колоній відразу ж приступають до вивчення їх токсиген-ності та ідентифікації. Токсигенні властивості досліджують не менше як у 2-х ізольованих колоній шляхом посіву однієї половини кожної колонії на середови-ще для визначення токсигенності і непропаленою петлею на середовище Пізу, а другої половини – на скошений сироватковий агар для виділення чистої культури та збереження її до закінчення лабораторної діагностики. В разі, якщо на чашці виростають одночасно токсигенні та нетоксигенні різновиди C. diphtheriaе, необ-хідно при множинному рості підозрілих колоній дослідити токсигенні властивості біля 20 колоній, засіваючи в одну бляшку матеріал із 5-6 колоній. При рості лише однієї колонії, її засівають на середовище для визначення токсигенності і, не про-жарюючи петлю, – у пробірку із середовищем Пізу.

Якщо застосовували транспортне середовище, висів із нього роблять на щільні кров’яно-телуритові середовища.

На третій день, при появі специфічних ліній преципітації в агаровому гелі й позитивній пробі на цистиназу, виділену культуру визначають як токсигенну С. diphtheriае. Якщо лінії преципітації через 24 год відсутні, чашки інкубують ще протягом доби. В разі негативної проби Пізу культуру ідентифікують як інший вид коринебактерій.

Чисту культуру на скошеному сироватковому агарі висівають на вуглевод-неві середовища з глюкозою, сахарозою, розчинним крохмалем, ставлять проби на виявлення уреази, піразинамідази та нітратредуктази.

На четвертий день роблять облік результатів усіх посівів і видають аргумен-тований бактеріологічний висновок про виділену культуру.

Використовують такі методи ідентифікації коринебактерій.

Визначення токсигенності in vitro. В його основі лежить взаємодія токси-ну з антитоксином в агаровому гелі. В місцях оптимального кількісного співвідно-шення токсину й антитоксину в товщі агару випадає преципітат у вигляді тонких ніжних білих ліній (“стріли”, “вусики”). Цей тест в багатьох країнах за кордоном називають Елек-тестом.

Пробу на токсигенність, як правило, проводять із чистими культурами. Мож-на визначити її і з культурами, забрудненими сторонньою мікрофлорою, що на добу прискорює лабораторну діагностику дифтерії. Але при негативній пробі її повторюють з виділеною чистою культурою.

Для постановки цієї проби мікробіологічна промисловість випускає спеці-альне сухе стандартне середовище для визначення токсигенності дифтерійних

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

мікробів (ВТДМ) і стандартні паперові диски, просочені антитоксичною проти-дифтерійною сироваткою і висушені.

На поверхню свіжовиготовленого середовища ВТДМ накладають паперові диски з антитоксином (не більше чотирьох на одну чашку). На відстані 0,5 см від диска навколо нього засівають культури у вигляді “бляшок” діаметром 7-8 мм, чередуючи “бляшки” досліджуваної культури і контрольного штаму.

Результати враховують через 18-24 і 48 год. Критерієм специфічності преци-пітатів є злиття ліній преципітації досліджуваної культури з лініями токсигенного штаму (рис. 78). В такому разі виділену культуру вважають токсигенною.

При відсутності стандартних паперових дисків можна використати смужки фільтрувального паперу, просочені дифтерійним антитоксином. Їх виготовляють безпосередньо в лабораторії. Нарізані за вказаними розмірами і простерилізовані в автоклаві при 121°С протягом 30 хв паперові смужки змочують 0,25 мл очище-ного дифтерійного антитоксину, який містить 500 МО в 1 мл. В такому разі на чашку з відповідним середовищем накладають змочену антитоксином смужку па-перу, підсушують, відкривши чашку на 15-20 хв у термостаті й перевернувши її догори дном. Після цього з обох боків смужки засівають культури “бляшками”, чередуючи досліджувані і контрольні штами.

Для визначення токсигенності збудника дифтерії можна використати також і інші середовища (АГВ, мартенівський агар тощо), рецепти виготовлення яких наведені в “Інструкції з бактеріологічної діагностики дифтерії”, Київ (1999).

Впродовж багатьох років токсигенність дифтерійних бактерій визначали підшкірним або внутрішньошкірним введенням культури двом гвінейським свин-кам, одній з яких напередодні вводять 100-1000 МО антитоксичної протидифте-рійної сироватки. Тепер цей метод бактеріологічні лабораторії практично майже не використовують через дорожнечу та значну затримку відповіді.

Останнім часом розроблено дуже чутливий і високоспецифічний метод виз-
начення гена дифтерійного токсину шляхом поліме-
ризації ланцюгової реакції. Він базується на визна-
ченні ділянки ДНК C. diphtheriaе, де локалізований
ген дифтерійного токсину, за допомогою специфіч-
них праймерів. Метод має переваги перед традицій-
ним визначенням токсигенності: високу чутливість,
швидкість отримання результатів (4-6 год), не потре-
бує виділення чистої культури. Але для його прове-
дення необхідні спеціальна апаратура, дорогі реак-
тиви й відповідне приміщення, а тому може бути про-
ведений лише в спеціалізованій лабораторії. Всі
нетоксигенні штами дифтерійних бактерій, які виді- Рис. 78. Визначення токсиген-
лені від хворих та бактеріоносіїв, необхідно направ- ^{ності C.diphthtriae:}

Визначення цистинази (проба Пізу). C. diphtheriaе, C. ulcerans виділяють фермент цистиназу, псевдодифтерійні бактерії та інші дифтероїди його не проду-кують.

Виділену культуру засівають уколом в середовище з цистином, розлите сто-впчиком у вузькі пробірки. Цистиназопозитивні бактерії розщеплюють цистин із виділенням сірководню, який із оцтовокислим свинцем, що входить до середови-ща, утворює сірчанокислий свинець, в результаті чого середовище забарвлюється в темно-коричневий колір. C. diphtheriaе викликає не лише потемніння середови-ща за ходом вколювання, а й утворює навколо нього “хмаринку” темно-коричне-вого кольору на відстані 1 см від поверхні. Результати враховують через 20-24 год інкубування в термостаті.

Визначення уреази (проба Заксе). Дифтерійні бактерії цього ферменту не утворюють. Позитивну пробу на уреазу дають лише деякі інші види коринебак-терій (табл. 56). Для постановки проби виділену культуру сіють на бульйон із се-човиною. Уреаза розкладає сечовину, змінює рН середовища, що супроводжуєть-ся його почервонінням. Якщо фермент не виділяється, зміни забарвлення бульйо-ну не відбувається.

Визначення піразинамідази проводять шляхом гідролізу піразинаміду до піразинової кислоти та амонію. Для цього в стерильну пробірку вливають 0,25 мл стерильної дистильованої води, в якій готують густу завись виділеної культури, потім вносять одну діагностичну таблетку Rosko 598-21. Інкубують протягом 4-х год при 37 °С, після чого добавляють одну краплю щойно приготовленого 5 % водного розчину сульфату амонійного заліза. При наявності ферменту суспензія набуває червоного або оранжевого кольору. Патогенні коринебактерії не виділя-ють піразинамідазу, а отже, й не змінюють кольору суспензії.

Цукролітичні ферменти визначають шляхом посіву повної петлі виділеної культури в кожну пробірку вкороченого строкатого ряду Гісса (глюкоза, сахароза, розчинний крохмаль). Результати враховують через 24 год інкубування в термо-статі. Розщеплення крохмалю може затримуватись до 48 год. Диференціація різних видів коринебактерій за основними біохімічними властивостями подана в таб-лиці 56.

Визначення нітратредуктази є додатковим тестом для ідентифікації С. belfanti i C. ulcerans, які не утворюють цього ферменту. У пробірку з бульйо-ном, до якого додають 0,1 % KNO₃, засівають досліджувану культуру, інкубують в термостаті протягом доби. Обов’язково ставлять контроль з незасіяним середови-щем. В разі наявності нітратредуктази при додаванні до засіяного бульйону 3-х крапель реактиву Касаткіна виникає червоне забарвлення. Середовище в конт-рольній пробірці кольору не змінює.

Для ідентифікації коринебактерій останнім часом використовують паперові індикаторні диски з глюкозою, сахарозою, сечовиною та крохмалем із набору “Б” для ідентифікації ентеробактерій (фірма “ІмБіо”, м.Нижній Новгород). У 4-х про-бірках готують густу завись досліджуваної культури і в кожну з них занурюють диск із відповідним вуглев одом чи іншим реактивом. Після інкубування в термо-

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 990 | Нарушение авторских прав