АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Імуноблотинг

Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти біополімери, од-нак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які були розділені при електрофорезі досить важко. Це пов’язано з тим, що локалізовані в порах гелю біополімери недоступні для специфічних антитіл, оскільки діаметр пор мат-риці значно менший за розміри антитіл. У зв’язку з цим було розроблено методи-ку, яка дозволяє вилучати розділені молекули з гелю, переносити і фіксувати їх на поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій вони знаходились у гелі. Таким чином, досліджувані антигени, розміщуючись на поверхні нового носія (твердій фазі), стають доступними для наступних досліджень.

Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та імобілізація їх на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а одержаний відбиток – блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані антигени спочатку розділяють з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані фракції електрофоретично переносять на листок нітроцелюлози (блот), який знаходиться в спеціальній камері. Фіксовані блоти обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і додають радіоактивно мічений ко н ’югат для виявлення антитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок нітроцелюлози розміщують в касеті з рентгенівською плівкою для радіоавтографії. На проявленій плівці появляться смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені антитіла.

Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні антитіла або антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку субстрат для ензиму (хромоген) повинен бути попередньо нанесений на нітроцелюлозну мембрану.

Існує багато різноманітних методів, в яких використовується блотинг, наприк-лад, дот або спот блотинг, Southern блотинг, Northern блотинг, Western блотинг. Всі вказані методи можна віднести до двох груп: тих, в яких використовується гібридизація нуклеїнових кислот і тих, які базуються на феномені реакції анти-ген-антитіло.

Частина ІІ. Імунологія

Реакції гібридизації блотинг – високоспецифічні, їх суть полягає у викорис-танні одноланцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) (генетичний зонд), яка комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК. Генетичні зонди, що застосовуються в таких реакціях одержують шляхом клонування плазмід, штучного синтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на відміну від РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділити дві комплементарні нитки ДНК шляхом нагрівання. Тод і мічена радіоактивним ізо-топом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК. Проте кращою міткою генетичного зонду є біотин. Біотин – розчинний у воді вітамін Н, в структурі якого знаходиться залишок деоксиуридинтрифосфата, який є структурним аналогом трифосфату тимідину. Завдяки цьому біотин вмонтовується у нитку ДНК на місце тимідину, виконуючи роль маркера. Якщо зонд в досліджуваному матеріалі знайде комплементарну йому нитку нуклеїнової кислоти, то його можна виявити, додаючи авідин, зв’язаний з ензимом (пероксидаза хрона). Авідин – білок, який знаходиться в яйці, специфічно здатний зв’язуватись з біотином. Кожна молекула авідину має чотири рецептори, які реагують з біотином. Таким чином, молекули авідину реагу-ють з біотином, який знаходиться в гібридизованому зонді, свідченням чого є зміна забарвлення, зумовлена дією ензиму на специфічний субстрат. Зонди з біотином можна виявити, використовуючи мічені флуорохромом антитіла проти біотину.

Реакції гібридизації блотинг проводяться на мембранах, які містять мікропо-ри і виготовлені з нітроцелюльози або нейлону.

Вестерн імуноблотинг використовується для виявлення антимікробних, антивірусних і протигрибкових антитіл. З цією метою очищені білки (бактерій, вірусів, грибів) розділяють шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі. В останньому білки мігрують і розділяються один від одного, утворюючи невидимі дуги, які складаються з білків різної молекулярної маси. Після розділення дуги електрофоретично переносять на нітроцелюльозну мембрану, що є тою основою, на якій можна буде виявити антитіла проти індивідуальних білків. Мембрану ріжуть на смуги шириною в декілька міліметрів перпендикулярно до дуг і інкубують їх певний час з досліджуваною сироваткою, яка містить антитіла проти білків. Смуги промивають для усунення антитіл, які не зв’язались, і додають мічену антиглобулі-нову сироватку. Після чого смуги повторно промивають для видалення антиглобу-лінових мічених антитіл і спостерігають вже видимі дуги в тих місцях, де насту-пила реакція між антигенами і антитілами. У цьому методі можна використовува-ти мічені ізотопом антитіла (рис. 57).

Однак, як показали численні спостереження кращим маркером є біотин, за-стосування якого значно підвищує чутливість реакції і вилучає небезпеку, пов’я-зану з радіоактивним випромінюванням. Проте застосування біотину вимагає до-даткової інкубації і промивання (одне після додавання авідину, який специфічно зв’язується з біотином; друге після внесення субстрату). В результаті хімічної ре-акції наступає зміна кольору і дуги стають видимими.

Вестерн імуноблотинг – різнопланова методика, яка вживається для дослі-дження різних аспектів імунологічної відповіді в процесі розвитку інфекційного

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Антиген

_ _^_ _

Пе ренос (блот) вірусних

біл ків на нітроцелюлозну

мембрану

Антиглобулінова

мічена ензимом

сироватка

V

Субстрат

+ + + + Електрофоретичне розділення антигенів вірусу

Розрізання мембрани Кольорові смуги утворились в
та ін кубація місцях з’єднання антитіл сиро-

із сироваткою хворого ватки хворого з антигенами вірусу

Рис. 57. Схема постановки імуноблотингу.

процесу. З її допомогою можна визначати антитіла не тільки класу IgG, але також анти-IgM, анти-IgA, анти-IgE.

Вестерн блот – методика, яка підтверджує факт зараження ВІЛ на основі ви-явлення антитіл. Вона використовується для диференціації ВІЛ 1 і ВІЛ 2, а також при змішаній інфекції ВІЛ 1 і ВІЛ 2. Все частіше її застосовують для діагностики захворювань, викликаних іншими вірусами і бактеріями (наприклад, Т. pallidum, B. burgdorferi).

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 2462 | Нарушение авторских прав