АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Реакція преципітації (РП)

За своєю сутністю реакція преципітації аналогічна реакції аглютинації. В ос-нові її механізму лежить утворення і випадання в осад комплексів антиген-анти-тіло. Проте вона відрізняється за характером антигенів: в реакції аглютинації вони корпускулярні (цілі клітини), а в реакції преципітації – молекулярні, в розчинному стані. Антигенами можуть бути екстр речовини.

Феномен преципітації поля-

гає в тому, що антитіла (преципі-

тини), з’єднуючись із розчинними

антигенами (преципітиногенами),

зумовлюють утворення осаду (пре-

ципітату) або помутніння розчину

(рис. 48). За титр реакції прийма-

ють найбільше розведення антиге-

на, яке дає позитивний результат.

Р

ис. 48. Схема реакції преципітації. Реакція преципітації значно

більш чутлива від реакції аглютинації й дозволяє виявити антиген у дуже малих

кількостях. Її можна проводити в рідкому і щільному середовищах. Обов’язковою

умовою постановки реакції в рідкому середовищі є прозорість компонентів.

Реакція відбувається при змішуванні розчинів антигена й антитіла або наша-руванні одного компонента на інший. В останньому випадку на межі двох реа-гентів утворюється преципітат у вигляді кільця. Тому така реакція одержала назву реакції кільцепреципітації.

Методика постановки реакції кільцепреципітації. У вузенькі преципі-таційні пробірки наливають 0,5 мл преципітуючої сироватки, а потім обережно пастерівською піпеткою нашаровують по стінці пробірки відповідний антиген. У випадку позитивної реакції через 5-30 хв на межі двох рідин з’являється видиме на темному фоні кільце молочно-білого кольору.

Для аналізу складу антигенів широкого поширення набула реакція преципі-тації в гелі. Розрізняють просту і подвійну дифузію в гелі.

Проста імунодифузія (реакція Удена). Агаровий гель, який містить преци-пітуючу сироватку, поміщають у вузькі пробірки і зверху наша-ровують розчин антигена. Ди-фундуючи в гель, антиген зв’я-зується з відповідними анти-тілами, утворюючи мутні лінії преципітації (рис. 49, а). Розмі-щення ліній в агарі визначаєть-ся концентрацією відповідного антигена.

Частина ІІ. Імунологія

Подвійна імунодифузія за Оклі і Фулторпом. На відміну від попереднього методу у подвійній імунодифузії реагенти розділені шаром нейтрального гелю, який не містить реагентів. На поверхню гелю, змішаного з специфічною сироват-кою, вносять шар нейтрального гелю, після застигання якого нашаровують анти-ген. Дифундуючи назустріч один одному, антиген і антитіла зустрічаються в шарі нейтрального гелю та утворюють лінії преципітації (рис. 49, б).

Подвійна радіальна імунодифузія за Ухтерлоні. В агарі, який розлитий тон-ким шаром в чашках Петрі або на предметних скельцях, за допомогою спеціаль-них штампів роблять круглі лунки на однаковій відстані одна від одної (4-10 мм).

У лунки вносять досліджувану сироватку і роз-

чин антигену в різних розведеннях або різні ан-

тигени. Із лунок антигени й антитіла дифунду-

ють назустріч один одному, і в точці їх оптималь-

ного співвідношення утворюється преципітат у

вигляді тоненьких білих ліній. Якщо в сироватці

є різні антитіла або антигени декількох видів,

^{Рис. 50. Реакція подвійної} з’являються декілька ліній преципітації (рис. 50).

^{імунодифузії в гелі (Ухтерлоні).} Ухтерлоні розрізняв 4 основні варіанти ре-

акції між антигеном і антитілом (рис. 51):

1) при взаємодії ідентичних антигенів із специфічними антитілами лінії пре-ципітації зливаються, утворюючи дугу;

2) коли обидва антигени неідентичні – лінії преципітації перехрещуються при умові, що сироватка містить антитіла проти двох антигенів;

3) при частковій ідентичності лінії преципітації нагадують дугу із шпорою. Чим більшою є спорідненість антигенів, тим менше виражена шпора і розміщується ближче до дуги;

4) обидві лінії перехрещуються і одночасно зливаються. Це означає, що обидва антигени містять як однакові, так і різні детермінанти, які вступають у реакцію з антитілами поліспецифічної сироватки.

Однією із різновидностей реакції преципітації в гелі є проста радіальна іму-нодифузія за Манчіні. За її допомогою визначають концентрацію імуноглобулінів у сироватці крові.

Методика постановки реакції наступна. Розтоплений агар при температурі 56 °С змішують з відповідною антисироваткою (анти IgG, IgM чи IgA) у співвідно-

Антиген А Антиген А Антиген А1 Антиген А
О /Ч О О / О

О Сироватка анти А

Рис. 51. Варіанти результатів реакції імунодифузії за Ухтерлоні.

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

шенні 3:1 і швидко виливають у чашку Петрі або на скляні пластинки. Після його
застигання з допомогою трафарету роблять лунки. У кожну дослідну лунку вно-
сять по 0,5 мкл досліджуваної сироватки. У чотири контрольні лунки додають у
чотирикратних розведеннях стандартну сироватку з відомим вмістом імуногло-
булінів. Після чого чашки або пластинки поміщають у вологу камеру (ексикатор)
на 24-48 год при 4 °С і оцінюють результати реакції. Вимірюють діаметри кілець
преципітації навколо лунок. За величиною цих діаметрів кілець преципітації на-
вколо лунок із стандартною сироваткою будують калібрувальну криву. При цьому
враховують, що у певному інтервалі концентрації імуноглобулінів діаметр кільця
прямо пропорційний логарифму концентрації імуноглобулінів (рис. 52).
Зона преципітації Розчин досліджуваної сироватки

Розчин сироватки анти Ig G в 1 % гелі

1 2 34

Рис. 52. Реакція радіальної імунодифузії за Манчіні.

Феномен преципітації широко використовується в мікробіологічній практиці. Зокрема, в судово-медичній експертизі його застосовують для визначення видової належності крові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка людини, різних тварин і птахів можна встановити, якому виду належить виявлена кров. Таким же чином визначають можливу фальсифікацію продуктів (м’ясо, мед). Ця реакція застосовується для діагностики епідемічного цереброспі-нального менінгіту, чуми, дизентерії тощо. Особливе значення має реакція термо-преципітації Асколі, яку використовують для визначення інфікованості збудником сибірки продуктів і матеріалів тваринного походження (шкіра, хутро, щетина). Із досліджуваного матеріалу шляхом кип’ятіння екстрагують сибірковий антиген, який потім використовують для реакції.

Реакція Ухтерлоні за інформативністю переважає всі інші методи, в основі яких лежить феномен преципітації. Її використовують для визначення антигенно-го складу органів і тканин, як нормальних, так і пухлинних, кількості антигенів у складних системах. Вона має важливе значення в діагностиці дифтерії, віспи та інших захворювань.

Зустрічний імуноелектрофорез. При діагностиці різноманітних бактеріаль-них і вірусних інфекцій досить часто використовують метод зустрічного електро-форезу, результати якого можна одержати вже через 1-2 години після надходжен-ня матеріалу в лабораторію. Будучи порівняно простим у методичному відношенні, він, як і всі імунодифузійні методи, відзначається дуже високою специфічністю.

Імуноелектрофорез є поєднанням двох методів – електрофорезу в гелі і на-ступної після нього подвійної імунодифузії.

Частина ІІ. Імунологія

Для проведення реакції імуноелектрофорезу використовують скляні пластин-ки, предметні скельця, на які наносять тонкий шар агару або агарози. Спочатку антигени розміщують у центрі пластинки і розділяють їх в електричному полі. Потім у канавку, зроблену в агарі паралельно до лінії розділу антигенів, вносять специфічну сироватку. Дифундуючи назустріч один одному, антигени і антитіла у місці контакту утворюють дуги преципітації (рис. 53).

Основні етапи проведення зустрічного лектрофорезу:

1. Наносять розтоплений гель тонким шаром 1,2-1,7 мм на поверхню скляної пластинки. Після застигання з допомогою спеціального шаблона вирізають в ньо-му лунки.

2. У лунки вносять досліджуваний матеріал і стандартні реагенти (антиген-місткий матеріал – ближче до катода, імунну сироватку – ближче до анода).

Якщо процедуру проводять на ацетилцелюлозних мембранах, то наносять по одній краплі реагентів на поверхню попередньо зволоженої мембрани.

3. Скляні пластинки розміщують в апараті і

проводять електрофорез
* при оптимальній напрузі

і визначеній силі струму протягом 30-60 хв.

4. Попередній облік
результатів проводять за

Ро_{1міщенН}я ок_РЄМ„* кількістю ліній преципі-

тації, їх локалізації, част­
ковою чи повною іден-
Сиецнфі™ «пр.™ тичністю івнянні із

стандартними реаген­тами.

5. Промивають пла-

■Д_Уг_И преципітації стинки у відповідному

розчині, фарбують, вису-шують і проводять заключ-

Рис. 53. Схема проведення зустрічного імуноелектрофорезу. ний облік результатів.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 2521 | Нарушение авторских прав